嵌合抗菌肽的研究

I n v itro acti v ity of cef m et azole aga i n st Extended2Spectru m Bet a2l act ama ses

produc i n g and none2produc i n g stra i n s:A com par ison w ith cefox iti n

Zheng Q in,KangM ei,Guo Xiaojing,Chen Hui L i,Yan Kening,Chen Zhixing,J ian Jun,Chen W enZhao,Lv XiaoJu (Depart m ent of ClinicalM icr obi ol ogyW est China Hos p ital,Sichuan University,Corres ponding author:M eiKang,Chengdu　610041)

Abstract　O bjecti ve:T o deter m ine in vitr o antibi otic activity of Cef metazole and Cef oxitin against extended2s pectru m beta2lacta mases (ES BL s)p r oducing and non2p r oducing strains.M ethod:520strains of K.pneu moniae and E.coli were is olated fr om January2004t o De2 ce mber2004.Phenotyp ic confir mat ory test was used t o detect ES BL s;Kirby2Bauer agar diffusi on method was used f or drug sensitive test.Re2 sults:226ES BL s strains were detected,the positve rate was43.5%,a mong which E.coli was45.8%,and K.pneu moniae was39.6%re2 s pectively.I n vitr o anti m icr obial activity of Cef metazole against Extended2Spectru m Beta2lacta mases p r oducing strains was higher than that of Cefoxitin in west china hos p ital.Conclusi on s:cepha mycins can be the alternatives f or ES BL s p r oducing strains,and in vitr o anti m icr obial ac2 tivity of Cef metazole against Extended2Spectru m Beta2lacta mases p r oducing was higher than that of Cef oxitin in west china hos p ital.

Key words　Cef metazole Cefoxitin Extended2Spectru m Beta2lacta mases I n vitr o anti m icr obial activity

综 述

嵌合抗菌肽的研究

王伯瑶,黄宁,吴琦,冯云

(四川大学华西基础医学与法医学院,成都　610041)

嵌合蛋白(Chi m eric p r otein)是20世纪90年代发展起来的

一种基因工程技术,通过PCR拼接技术,将2个或以上生物活

性蛋白或其功能结构域编码基因偶联起来,以产生新的生物活

性蛋白。比如CD

4免疫粘附素。C D

4

分子是一种辅助T淋巴

细胞和巨噬细胞的跨膜蛋白,是爱滋病病毒(H I V)的受体,H I V

通过CD

4

复合受体进入和感染T淋巴细胞和巨噬细胞,导致免

疫功能受损。CD

4

跨膜蛋白的细胞外区段可从细胞膜上脱落下

来,进入血循环,这个细胞外区段称为可溶性CD

4

分子,它可以

与H I V外膜糖蛋白特异结合。CD

4免疫粘附素就是将CD

4

分

子的细胞外区段的编码基因与I gG的轻链和重链基因偶联产生

的,它增强了可溶性CD

4

分子结合爱滋病病毒的效价,提高了

可溶性C D

4

在血中的半衰期和穿透胎盘的能力。21世纪初叶国外有报道将人2防御素22(h BD22)成熟肽编码基因与无免疫原性的小鼠骨髓瘤细胞特异抗原(I g)基因偶联,获得一个新的DNA疫苗,免疫小鼠,产生极强的针对小鼠骨髓瘤细胞的特异抗体和CT L反应,并保护小鼠免遭小鼠骨髓瘤细胞毒株的致死性攻击。我们对嵌合抗菌肽的研究主要集中在增强我们自己新近鉴定出的人LAK细胞抗菌多肽HMG N2生物学功能上。1.H MG N2的抗菌作用及其抗菌结构域

我们应用微量电泳凝胶琼脂糖弥散抗菌检测法、制备性酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶洗脱电泳和反向高效液相色谱技术,分别从人LAK细胞和子宫颈黏液中分离鉴定出一个抗菌多肽,经N2端氨基酸序列测定、质谱分析、全长c DNA克隆和免疫印迹等实验证明为H M G N2。

H M G N2属于高迁移率非组蛋白(H igh mobility gr oup chr o2 mos omal p r otein,H MG)家族成员,是脊椎动物和非脊椎动物细胞核中含量最丰富的非组蛋白家族,早期研究认为H M G N2与DNA复制和转录活性有关。我们首次发现H M G N2的抗菌活性,为了证明H M G N2在免疫反应中发挥作用,我们对其亚细胞定位特别是免疫反应时的定位分布进行了研究,应用免疫荧光细胞化学染色与共聚焦显微镜观察、E L I S A和W estern B l otting 等多种实验方法证明人单个核细胞经I L22刺激成为LAK细胞时,部分HMG N2由胞核转移至胞浆,进而分泌到胞外。构建带六组氨酸臂标签的H M G N2重组真核细胞表达质粒pc DNA3.12 myc2his2HMG N2,转染人宫颈上皮Hela细胞株,用抗六组氨酸臂的单克隆抗体经免疫细胞化学染色与共聚焦显微镜观察显示,新合成的带六组氨酸臂标签的HMG N2除导向于(targeting)细胞核外,还分布于细胞浆中,E L I S A和免疫印迹显示亦分泌到细胞外。人子宫颈组织标本免疫组织化学染色显示H MG N2主要分布于上皮组织表面和宫颈黏液中,免疫印迹显示感染性子宫颈黏液H MNG2的表达量比正常者高。

我们还对HMG N2的二维结构与抗菌功能的关系进行了研究。从一级结构看H M G N2氨基酸序列中无半胱氨酸,不可能形成2片层,因此应用JAN I N和Kyte2Doolittle分析法分析了H MG N2的亲疏水性,应用Agr os和Von Heijne软件分析法分析了HMG N2的2螺旋结构,结果显示位于第17242位氨基酸残基范围有一个2跨膜螺旋结构域,具双亲性。于是我们合成了H MG N2分子的2跨膜螺旋结构域、N2末端和C2末端肽片段进行抗菌活性检测,抗菌检测显示仅仅2螺旋结构肽片段具抗菌活性。

2.HMG N22跨膜螺旋结构域嵌合抗菌肽的研究

为了进一步证明H M G N22跨膜螺旋结构域的抗菌作用和

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四川生理科学杂志2005;27(4)