利用基因芯片检测转基因作物

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2. 3
待检样品杂交扫描结果 待测样品扫描结果表明, 转基因作物检测型芯
片可以从样品模板 DNA 中检测到部分报告基因、 抗 性基因、 终止子或启动子的信号。而阴性对照都没 有杂交信号 , 表明杂交体系正确 , 没有非特异杂交的 干扰。扫描图片经我公司开发的 GeneArrays Spy 软件 分析后得出结论: 在水稻中检测到 CaMV 35S 终止子 和 CaMV 35S 顺式启动子; 木瓜中检测到 Gus 报告基 因和 CaMV 35S 反式启动子 ; 玉米中检测到 kan 抗性
Detection of Transgenic Crop with Gene Chip
HUANG Ying - Chun, SUN Chun - Yun, FENG Hong, HU Xiao - Dong, YIN Hai Bin
( Chengdu Bioinf ormation Technique Incorporati on, Dongsheng Rood N o. 8, Chengdu 610015, China)
遗
传 HEREDITAS( Beij ing) 25( 3) : 307~ 310, 2003
研究报告
利用基因芯片检测转基因作物
黄迎春, 孙春昀, 冯
摘
红, 胡晓东, 尹海滨
( 成都百奥生物信息科技有限公司 , 成都东胜街 8 号 610015)
要 : 选用常用的两种报告基因、 两种抗性基因、 两种启 动子序列 和两种终 止子序列 为探针 , 将 其 PCR 扩增产 物 型全自动点样仪按矩阵排列点样于包 埋有氨基的载玻片上 , 制备成转基因作物检测型基因 芯片。利
片微点阵表面, 用一片 22mm
其上 , 然后放置在杂交盒中, 于 60
次用 1 SSC+ 0. 03% SDS 水溶液、 0. 2 液、 0. 05 SSC 水溶液洗涤芯片, 晾干。 1. 5 杂交结果的检测
TM
2. 2
新鲜材料与干种子总 DNA 提取的比较
采用 CTAB 方法从新鲜材料中 提取水稻、 木瓜 样品的总 DNA 质量很好, 以 0. 7% 琼脂糖凝胶电泳, 结果显示 DNA 完整无降解, 大小在 23kb 以上。玉 米、 大豆的干种子为不新鲜的材料, 并且含有较多的 淀粉等糖类物质 , 对 DNA 的提取有很大的干扰, 因 此 , 提取的总 DNA 出现降解现象, 如图 2。
杂交结果在 GeneTAC LS IV Biochip Analyzer 基 因芯 片 扫 描 仪 上 在 波 长 为 560nm ( Cy3 标 记 ) 或 660nm( Cy5 标记) 处进行扫描检测 , 利用我公司开发 的 GeneArrays Spy 软件分析杂交信号, 经多次反复试
3期
黄迎春等 : 利用基因芯片检测转基因作物
[ 5]
验将扫描强度为 50% ~ 60% 时的信号 CUT- OFF 值 定为 10。
2
2. 1
结果与分析
转基因作物检测型基因芯片的矩阵图 利用 MicroGrid 型基因芯片全自动点样仪点
样 , 设计成 4 5 4 阵列 , 包含 8 条检测目标探针, 2 条阴性对照, 每种探针重复 4 个点。其矩阵图见图 1。芯片设一段与检测探针几乎没有同源性的人类 基因为阴性对照, 以作为信号参照, 排除杂交过程中 非特异杂交的干扰。调整探针溶液浓度 , 使芯片上 探针量为 400~ 600pg 。
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1. 1
材料和方法
转基因作物检测基因芯片的制备 选用目前常用的 - 葡糖 醛酸糖苷酶报 告基因
( Gus) 、 绿色荧光蛋白报告基因 ( Gf p ) 、 卡那霉素抗性 基因( Kan) 、 潮霉素抗性基因 ( Hgy ) 、 花椰菜花叶病
收稿日期 : 2002- 05- 17; 修回日期 : 2002- 10- 21 作者简介 : 黄迎春 ( 1972- ) , 女 , 成都人 , 硕士 , 从事基因芯片研究开发工作。Tel: 028- 86260468- 232, E -mail: ychuang72@ yahoo. com. cn 通讯作者 : 尹海滨 ( 1964- ) , 男 , 专业 : 病毒学。地址 : 成都市东胜街 8 号庄森大厦 10 楼 , E -mail: hmikeyin@ hotmail. com
Abstract: Some selected available sequences of reporter genes, resistant genes, promoters and terminators are amplified by PCR for the probes of transgenic crop detection gene chip. These probes are arrayed at definite density and printed on the surface of amino - slides by bioRobot MicroGrid maize and soybean were applied. Key words: gene chip; transgenic crop; detection . Results showed that gene chip worked quickly and correctly , when transgenic rice, pawpaw,
[ 1]
寡核苷酸探针密集排列的矩阵, 其基本原理为通过 杂交检测信号 [ 3, 4] 。利用基因芯片可实现对 DNA 的 准确、 快速、 大信息量的检测。我们的转基因作物检 测型基因芯片以基因芯片为平台, 同时对转基因作 物中常用的共 7 种报告基因、 抗性基因、 启动子和终 止子序列进行检测分析 , 从而方便、 快速地对大量待 检测转基因作物进行灵敏、 准确的检测。
Fig. 2 Electrophoresis analysis of template DNA of samples
1: DNA marker, DNA - H ind ; 2~ 3: templat e DNA isolated from leaf of rice and pawpaw with CTA B extraction; 4: templat e DNA isolated form seeds of maize and soybean.
物 DNA 样品进行扩增和 Cy5 或 Cy3 标记。反应体 系为: 1 PCR 缓冲液, 0 2 mmol/ L dATP, 0 2 mmol/ L dGTP, 0 2 mmol/ L dTTP, 0 1 mmol/ L dCTP, 20 mol/ L Cy3 - dCTP( 或 Cy5 - dCTP) , 500nmol/ L 混合引物 , 2 5 U Taq DNA 聚合酶 , 适量 DNA 模板, 双蒸水加到总体 积 50 L。反应程序为: 94 预变性 4min; 94 60s,
50 60s, 72 60s, 30 个循环 ; 72 后延伸 5min 。扩 增产物加入 5 g 鲑鱼精 DNA, 经酒精共沉淀后再溶 解于 15 L 杂交液 ( 3. 4 SSC, 0. 3% SDS) 中。 1. 4 杂交和洗涤 标记探针于 95 水浴变性后, 取 15 L 铺 在芯 22mm 的盖玻片覆盖 杂交 4~ 6 h; 依 SSC 水溶
用 MicroGrid
用该芯片对 4 种转基因水稻、 木瓜、 大豆、 玉米进行检测 , 结果 表明 , 该芯片能对转基因作物做出快速、 准确的检测。 关键词 : 基因芯片 ; 转基因作物 ; 检测 中图分类号 : Q785 文献标识码 : A 文章编号 : 0253- 9772( 2003) 03- 0307- 04
array map of transgenic crop detection gene chip
A1~ 4, L1~ 4: negative control; B1~ 4: Gus probe;
C1~ 4: Gf p probe, D1~ 4: Hgy probe; E1~ 4: K an probe; F1~ 4: nos t erminator probe; G1~ 4: CaMV 35S t erninator probe; H1~ 4: CaMV 35S cis- promoter probe; I1~ 4: CaMV 35S trans- promoter probe.
Fra Baidu bibliotekFig. 1 图 1 转基因作物检测型 基因芯片的矩阵图
A1~ 4, L1~ 4: 负对照 ; B1~ 4: Gus 探针 ; C1~ 4: Gfp 探针 ; D1~ 4: Hgy 探针 ; E1~ 4: K an 探针 ; F1~ 4: nos 终止子探针 ; G1~ 4: CaMV 35S 终止子探针 ; H1~ 4: CaMV 35S 顺式 启动子探针 ; I1~ 4: CaMV 35S 反式启动子探针。
图 2 样品模板 DNA 的电泳分析
1: DNA 标准分子质量 , DNA - H in d ; 2~ 3: CTA B 法提取水稻和木瓜果叶片模板 DNA; 4: 提取的玉米和大豆种子的模板 DNA 。
基因和 CaMV 35S 终止子; 大豆中检测到 Nos 终止子 和 CaMV 35S 顺式启动子( 见图 3) 。 2. 4 待检样品的 PCR 结果分析 分别用单对引 物对已 检样 品 DNA 进行 扩增。 电泳分析结果表明: 在经该芯片检测为转基因作物 的样品 DNA 中 , 阳性片 段能扩增 出预计大 小的片 段 , 而阴性片段则没有扩增出来 ( 见图 4) 。这个结 果表明 , 芯片检测过程中多重 PCR体系能准确地扩
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传 HEREDITAS ( Beijing ) 2003
25 卷
毒 CaMV 35S 启动子、 CaMV 35S 终止子和胭脂碱合 成酶基因 ( Nos ) 终止子作为检测片段, 分别设计扩增 引物, PCR 扩增得到探针。纯化、 浓缩、 95 水浴变 性后利用 MicroGrid 型基因芯片全自动点样仪将 探针和阴性对照点样于包埋有氨基的载玻片上。玻 片经 水 合、 干 燥、 UV 交 联 后 用 0. 2% SDS 洗 涤 10min, H 2O 洗涤 10min, 晾干备用。 1. 2 转基因作物 DNA 的提取 转基因作 物木瓜 果、 水 稻叶为 新鲜 材料, DNA 提取选用 CTAB 法 ; 转基因作物大豆、 玉米选用颗 粒饱满 的 种子 , 浸泡 过 夜 后加 入 20ml 溶液 I ( 10 mmol/ L MgCl2 , 10mmol/ L Tris Cl, pH7. 5, 0. 2 mol/ L NaCl) , 捣 碎 后 加 入 0. 5ml 20% Triton - 100, 搅 拌 45min 后过滤。中速离心去上 清, 沉淀中 加入 20ml 溶液 ( 10mmol/ L MgCl2 , 10mmol/ L Tris Cl, pH7. 5, 0. 5% Trixon- 100) , 混匀后中速离心去上清。沉淀 中加入 5ml 1% SDS 混匀后中速离心 5min, 将上清转 移到 10ml 的离 心管 中。加 入 10% 体积 的 3mol/ L NaAc, 2 体积无水乙醇沉淀 , 70% 乙醇清洗后烘干 , 溶于适量 TE 中。 1. 3 目的片段的扩增和标记 采用多重 PCR 方法对提取的被检测转基因作
转基因技术的应用使农作 物的育种得以 定向 化, 其在增强作物抗病虫害、 抗除草剂能力、 提高产 量、 降低生产成本等方面的优点是显而易见的。正 因为转基因作物具有独特的品质和特性, 使其在短 短的十几年间得以迅速发展 。但自从 1998 年底 英国普斯陶伊教授公布转基因马铃薯引起小白鼠免 疫系统损害的试验结果后, 转基因作物及食品的安 全性在世界上引起广泛争论, 而且它已从单纯的生 物遗传科学扩大为涉及生态环境、 政治和国际贸易 [ 2] 的焦点问题 。鉴于人们对转基因作物及食品安全 性的忧虑 , 对其进行检测并标识已成为必然需求。 基因芯片是 20 世纪 80 年代末在生命科学领域 中迅速发展起来的一项高新技术 , 是由大量 DNA 或