引物设计实例分析

• 为设计一条高效引物有几个参数必须考虑PRIMER PREMIER搜 索所考虑的参数依次如下 • Tm 融链温度：PRIMER PREMIER根据相邻二碱基对作用理论 nearest neighbor theory 来计算融链温度。PCR反应的合 适Tm范围为56到63°C。 • GC% GC含量：对于PCR反应来说GC含量在50%左右比较合适而 对于测序引物和杂交探针来说GC含量至少应为50%。 • Degeneracy 多义性：当设计多义引物时应尽量减少引物多 义性这样会带来更好的特异性应尽量避免3末端的多义性因 为这里即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸。 • 3’ End Stability 3 末端稳定性：引物稳定性影响它的错配 效率。一条理想的引物应该有一个稳定性较强的5 末端和相 对稳定性较弱的3 末端，如果引物3 稳定性强有可能在即使 5 末端不配对的情况下造成错配形成非特异性扩secondary bands。 而3 末端稳定性低的引物较好的原因是在引物发生 错配时由于3 末端不太稳定引物结合不稳定而难以延伸。
引物设计实例分析
引物设计基本原则
• • • • • 引物长度（primer length） 产物长度（product length） 序列Tm值 (melting temperature) G+C含量（composition） 引物二聚体及发夹结构 （duplex formation and hairpin） • 阅读框
PRIMER PREMIER能即时分析引物二级结构。在左下的两排按钮可以 显示发现了何种二级结构，也显示二级结构的自由能数值 G 单位 kcal/mol。
• Edit Primer 引物编辑窗口可以用来设计 用于定点突变的引物或分析一条已有引物 序列。可以使用CTRL-X CTRL-C和CTRL-V快 捷键来实施剪切拷贝和粘贴删除当前引物 序列,并从剪贴板上粘贴是分析一条已有引 物的好方法。进行粘贴时Paste 粘贴窗口 会激活，用以将引物序列转化为反向互补 或反向互补形式，也可以手工键入引物序 列。一旦引物被编辑发点击Analyze 按钮 即可分析编辑后的引物。
第二步：利用Primer Premier 5设计引物
Primer1: 5’ Primer2: 5’
ATGGCATCCAAAAGAG
………….. …….
TCTAGTCTTTGAGAACA
• Primer Premier5.0是由加拿大的Premier公司开发的专业用于PCR或 测序引物以及杂交探针的设计、评估的软件，其主要界面分为序列编 辑窗口（Genetank），引物设计窗口（Primer Design），酶切分析 窗口（Restriction Sites）和纹基分析窗口（Motif），这里我们主 要介绍其引物设计功能 。
• Pair Rating 匹配度评分
• 匹配度低的引物对常常不太有效，是因为在 同样退火温度下，Tm低的引物决定扩增的 特异性，而Tm高的引物更易于形成非特异 性结合而造成错误的起始。PRIMER PREMIER会计算每一对引物的匹配度100分 为满分并按照分数按降序排列计。
4. 引物的GC含量
有效引物中(G+C)的比 例为40-60%，过高或过低都 不利于引发反应。上下游引 物的GC含量不能相差太大。
5.碱基础随机分布
• 引物中四种碱基的分布最好是随机的， 不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′ 端不应超过3个连续的G或C，因这样会 使引物在G+C富集序列区错误引发。
LOCUS NM_057143 1097 bp mRNA linear ROD 1 gtgccgagca cagttactgg aaggcttaac caaagttttg atgcctggga accgcgcagg 61 aaaaacacgc ggaacgtgct tcacagtggc ggctaactgc tctcgttcgc tgtgcagagc 121 cgtctggcag ggttgacctc ctaaagggat attccatctt tattaatcat tagtagtgtg 181 gtcagagact tagcaccatt ggtctccccc aacctggtcc agacatttca gcagtttatc 241 ggaacagcaa caacagcaac aaaaccttca aaatttacaa gtctttaaga aatagaaatg 301 gcatccaaaa gagctctggt catcctagcc aaaggagcag aggagatgga gacagtgatt 361 cctgtggaca tcatgcggcg agctgggatt aaagtcaccg ttgcaggctt ggctgggaag 421 gaccccgtgc agtgtagccg tgatgtagtg atttgtccgg ataccagtct ggaagaagca 481 aaaacacagg gaccatacga tgtggttgtt cttccaggag gaaatctggg tgcacagaac 541 ttatctgagt cggctttggt gaaggagatc ctcaaggagc aggagaacag gaagggcctc 601 atagctgcca tctgtgcggg tcctacggcc ctgctggctc acgaagtagg ctttggatgc 661 aaggttacat cgcacccatt ggctaaggac aaaatgatga acggcagtca ctacagctac 721 tcagagagcc gtgtggagaa ggacggcctc atcctcacca gccgtgggcc tgggaccagc 781 ttcgagtttg cgctggccat tgtggaggca ctcagtggca aggacatggc taaccaagtg 841 aaggccccgc ttgttctcaa agactagaga gcccaagccc tggaccctgg acccccaggc 901 tgagcaggca ttggaagccc actagtgtgt ccacagccca gtgaacctgg cattggaagc 961 ccactagtgt gtccacagcc cagtgaacct caggaactaa cgtgtgaagt agcccgctgc 1021 tcaggaatct cgccctggct ctgtactatt ctgagccttg ctagtagaat aaacagttcc 1081 ccaagctcct gacggct
• False Priming 错配
• 如果引物可以结合除目的位点外的其他区域 扩增效率将明显降低，目的产物带将减少或 出现涂布（smear ），PRIMER PREMIER 会检查每一条引物是否会与整个序列的其他 位点形成局部的错配，3 末端连续几个碱基 配对形成错配的倾向要高于引物上游区域同 样数量的碱基配对。可以分别设定确认为错 配的3 末端或引物全长形成连续碱基配对的 数量。
• GC Clamp GC钳：引物与目的位点的有效结合需 要有稳定的5 末端，这一段有较强稳定性的5 末 端称为GC钳。它保证引物与模板的稳定结合。
• Secondary Structures 二级结构
• 二级结构是引物设计中必须考虑的一个重要因素 二级结构能显著影响反应中能与模板正确结合的 引物数量。发卡结构的存在能限制引物与目的位 点的结合能力，从而降低扩增效率。形成发卡环 的引物则不能在PCR扩增中发挥作用。
1. 引物的长度
一般为15-30bp，常用的是1827bp，但不能大于38，因为过长 会导致其延伸温度大于74℃，即 Taq酶(Taq酶是从水生栖热菌 Thermus Aquaticus （ Taq ）中
分离出的具有热稳定性的DNA 聚合酶。 对于PCR的应用有里程碑的意 义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶， 使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量
6. 引物自身
引物间3’端的互补、二聚体或发 夹结构也可能导致PCR反应失败
引物自身不应存在互补序列，否则引物自 身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。 这种二级结构会因空间位阻而影响引物与 模板的复性结合。若用人工判断，引物自 身连续互补碱基不能大于3bp。
7. 引物之间
两引物之间不应不互补性，尤应避免3′ 端的互补重叠以防引物二聚体的形成。 的是序列编辑参看
这是根据模板序列寻找引物的界面，在该界面中可以设定所要搜索的引 物的类型，包括PCR引物，测序引物和杂交探针以及引物所在的链；另 外也能设定搜索引物的范围，以及最终PCR产物的长度和引物的长度等。
Automatic Search 自动搜索
在结果窗口中给出了程序给该对引物的打分（rating）和上下游引物的起 始位置和长度以及产物的长度。通过直接点击各对引物在相应引物搜寻 界面中相应的显示引物的各种信息。包括其各种参数和各种可能存在的 不利结构。
• Hairpin 发卡结构 • 发卡结构的形成是由于引物自身的互补碱 基分子内配对造成,引物折叠形成的二级结 构，并由于发卡结构的形成是分子内的反 应,仅仅需要三个连续碱基配对.发卡结构 的稳定性可以用自由能衡量,自由能大小取 决于碱基配对释放的能量以及折叠DNA形成 发卡环所需要的能量,如果自由能值大于0 则该结构不稳定,从而不会干扰反应.如果 自由能值小于0 则该结构可以干扰反应。 按下按钮All 可以显示其具体结构。
• Dimer 二聚体
• 引物之间的配对区域能形成引物二聚体，它是相同 或不同的两条引物之间形成的二级结构。它造成引 物二聚体扩增并减少目的扩增，产物二聚体可以在 序列相同的两条引物或正反向引物之间形成，如果 配对区域在3 末端问题会更为严重，3 末端配对很 容易引起引物二聚体扩增使用Dimer Report功能 可以预测二聚体的形成。 • 引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5 ， 二聚体和发夹结构形成的能值越高越稳定，越不符 合要求。