应用MassARRAY技术高通量检测乙肝病毒耐药基因变异

应用MassARRAY技术高通量检测乙肝病毒耐药基因变异

发表时间：2017-11-16T13:29:15.827Z 来源：《航空军医》2017年第18期作者：陈清林1 吴卉卉2 骆时木2 [导读] 将MALDI-TOF-MS技术高通量检测乙肝病毒耐药性效果理想，具有灵敏度高、准确度高，能为临床诊断、治疗及疾病监测提供依据。

（1泉州市第一医院检验科福建泉州 362000；2泉州市第一医院检验科；泉州市第一医院检验科）摘要：目的探讨MassARRAY技术高通量检测乙肝病毒耐药基因变异性。方法利用MassARRAY技术软件设计iPLEX引物，根据说明书要求完成PCR扩增、SAP反应、引物延伸，并且利用MALDI-TOF-MS采集、分析iPLEX反应获得的相关数据，完成基因变异位点的确定。选择2014年12月-2017年3月到医院接受治疗的慢性乙型肝炎患者138例，采集多重耐药血清标本，将MALDI-TOF-MS检测获得的HBV基因变异位点区域完成DNA测序，并且将结果与MALDI-TOF-MS结果进行比较。结果拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦等单药耐药或多重耐药有关的基因位点主要包括：rtL180M、rtA181M、rtT184G及rtN236T。根据MassARRAY Assay Design软件设计的延伸引物，MALDI-TOF-MS同时检测、分析上述位点，结果相符。取PCR反应获得的产物2uL，在1%琼脂糖电泳下可见扩增产物为800bP；利用MALDI-TOF-MS技术高通量同时完成33份标本测定，10份标本出现与DNA测序结果不一致，2份标本MALDI-TOF-MS技术高通量未能检测到，1份存在2个检测位点不同。结论将MALDI-TOF-MS技术高通量检测乙肝病毒耐药性效果理想，具有灵敏度高、准确度高，能为临床诊断、治疗及疾病监测提供依据。

关键词：MassARRAY技术；高通量；乙肝病毒；耐药基因；变异性

乙型肝炎病毒属于是一种逆转录病毒，属于HBV的一个显著特点。从大的角度来说，HBV结构为环状双股DNA，由于逆转录复制过程中需要RNA聚合酶并且依赖RNA的DNA聚合酶作为其主要工具，导致该两种酶均无法对碱基的配对正误进行鉴别，自身也无法完成纠正，导致核苷酸错配率相对较高，将会造成HBV蛋白表达、表型发生变异[1]。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MassARRAY）技术是一种软电离技术，检测时由基质吸收激光能量，并将其传递给生物分子，使得生物分子发生电离，能实现混合物、生物大分子的检测[2]。因此，本课题以2014年12月-2017年3月到医院接受治疗的慢性乙型肝炎患者138例作为研究对象，探讨MassARRAY技术高通量检测乙肝病毒耐药基因变异性，报道如下。

1.资料与方法

1.1临床资料

选择2014年12月-2017年3月到医院接受治疗的慢性乙型肝炎患者138例，男83例，女55例，年龄（18-62）岁，平均（34.51±5.93）岁，病程（1-6）年，平均（3.25±0.81）年。入选患者均符合2010年慢性乙型肝炎防治指南中关于乙型肝炎临床诊断标准者，均对拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦等单药耐药或多重耐药。本课题在伦理委员会批准下完成，患者对检测方法等知情同意。

1.2 仪器与试剂

本课题所需仪器、试剂包括：MassARRAY Assay Design软件设计引物、Viriti384热循环仪、Nanodrop ND-100、MALDI-TOF-MS 仪、DL2000 DNA Maker等，具体厂家见表1。

1.3 方法

（1）标本的采集。入组患者入院后次日早晨空腹抽取3mL静脉血，静置后放置在抗凝管中，10min离心，速度为3000rpm，取上层清液放入1.5mL离心管中，放入4℃冰箱中备用[3]。（2）MassARRAY技术高通量分析。根据iPLEX反应操作说明书完成PCR扩增、SAP反应、引物延伸、脱盐、点样等操作步骤，利用MALDI-TOF-MS仪完成有关数据的采集、分析，从而判读基因变异的位点。（3）HBV P基因扩增。根据每一例标本不同设置相关反应体系，2.5uL 10×PCR Buffer，1.0uLdNTPs。上游产物0.5uL，浓度为100umol/L；下游产物0.5uL，浓度为100umol/L。0.1uL HotStar Tag DNA Polymerase，2.5uL模板DNA，18uL dH2O，整个反应体系总共25.0uL。设置反应条件：95℃下连续15min反应，95℃下连续40s反应，57℃下连续40s反应，72℃下连续1min反应，连续进行35个循环，最后在72℃进行10min反应，获得800bp PCR产物。（4）琼脂糖凝胶回收。根据AxyPreP DNA Gel Extraction kit说明书完成琼脂糖凝胶回收，并且利用DL2000 DNA Maker完成PCR产物序列的测定和分析[4-5]。

1.3统计分析

采用SPSS18.0软件处理，计数资料行检验，采用n（%）表示，计量资料行t检验，采用（）表示，P<0.05差异有统计学意义。 2结果

2.1 MALDI-TOF-MS技术高通量检测乙肝病毒基因变异位点

拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦等单药耐药或多重耐药有关的基因位点主要包括：rtL180M、rtA181M、rtT184G及rtN236T。根据MassARRAY Assay Design软件设计的延伸引物，MALDI-TOF-MS同时检测、分析上述位点，结果相符。

2.2 HBV P基因测序

取PCR反应获得的产物2uL，在1%琼脂糖电泳下可见扩增产物为800bP，见图1。

2.3 MALDI-TOF-MS技术高通量与测序结果比较

利用MALDI-TOF-MS技术高通量同时完成33份标本测定，10份标本出现与DNA测序结果不一致，2份标本MALDI-TOF-MS技术高通量未能检测到，1份存在2个检测位点不同。

3.讨论

近年来，MALDI-TOF-MS技术高通量在乙肝病毒耐药基因变异性中得到应用，且效果理想[6]。MALDI-TOF-MS技术高通量是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱技术，其检测时主要利用激光照射样品与基质形成共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量并且将其传递给生物分子。电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子中获得相应的质子，使得生物分子实现电离，而电离后的离子在电场作用下加速飞行飞过管道，根据达到检测器的飞行时间不同获得测定离子的质荷比与离子飞行时间之间成正比，从而能在质谱仪上获得不同的峰值[7]。本研究中，拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦等单药耐药或多重耐药有关的基因位点主要包括：rtL180M、rtA181M、rtT184G及rtN236T。根据MassARRAY Assay Design软件设计的延伸引物，MALDI-TOF-MS同时检测、分析上述位点，结果相符。MALDI-TOF-MS 技术高通量具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等优点，为生命科学领域提供一种强有力的分析手段，能为临床治疗提供依据和参考[8]。本研究中，利用MALDI-TOF-MS技术高通量同时完成33份标本测定，10份标本出现与DNA测序结果不一致，2份标本MALDI-TOF-MS技术高通量未能检测到，1份存在2个检测位点不同。提示：MALDI-TOF-MS技术高通量检测乙肝病毒耐药性诊断符合率较高，能满足临床需要。

综上所述，将MALDI-TOF-MS技术高通量检测乙肝病毒耐药性效果理想，具有灵敏度高、准确度高，能为临床诊断、治疗及疾病监测提供依据。

参考文献

[1]田红霞，张绪超，王震，等.MassARRAY质谱分析肺癌多基因突变方法的建立与应用[J].中国肿瘤临床，2015，42（17）：856-861.

[2]李伟佳，张志宏，郭巍，等.利用高通量测序技术快速解析草莓病毒基因组序列[J].沈阳农业大学学报，2016，47（05）：536-540.

[3]陈丁莉，李守霞，郭丽丽，等.冀南地区646例新生儿脐带血常见耳聋基因突变的高通量筛查[J].中国妇幼保健，2016，31（19）：4004-4008.

[4]陈瑶，苏跃青，周进福，等.Mass-array芯片技术在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变位点检测中的应用[J].中华检验医学杂志，2015，38（12）：822-826.

[5]林壹明，林卫华，余科，等.八例原发性肉碱缺乏症SLC22A5基因突变分析[J].中华医学遗传学杂志，2017，34（1）：35-39.

[6]王志剑，黄志东，邝永辉，等.河源地区乙肝病毒分型和耐药突变基因检测的应用[J].现代诊断与治疗，2016，27（10）：1837-1838.

[7]王志剑，郭振华.HBeAg 转阴前后慢性乙肝患者 HBV cccDNA 荧光定量检测的意义[J]. 国际检验医学杂志，2015，（6）：806-807，810.

[8]付艳玲，余祖江. 核苷类似物治疗慢性乙型肝炎耐药现状及进展[J]. 中国实用内科杂志，2015，35（4）：370-373.