钙离子相关信号蛋白

钙离子相关信号蛋白
王涵兴
摘要：力学信号在骨骼内的转导通过4个阶段，即力学耦联、生化耦联、信号传递和效应细胞反应，将作用在骨骼上的应力信号转导为生物化学信号。

骨骼细胞中的转导途径有：细胞膜离子通道(特别是牵拉激活的阳离子选择性通道)、与G蛋白耦联的磷脂酶c通路、细胞内钙离子和整合素一细胞骨架等。

钙离子是力学刺激信号传导中重要的第二信使, 在信息传递中起着多方面的作用。

本文就由于钙离子作为第二信使，而将细胞中串联起来的钙网织蛋白和膜联蛋白做简要介绍，并简略讨论力学刺激与软骨细胞的关系。

关键词：力学刺激钙网织蛋白膜联蛋白软骨细胞钙离子膜联蛋白I 信号通路
钙网织蛋白（Calreticulin，CRT）
钙网织蛋白（Calreticulin，CRT），属于内质网伴侣蛋白，目前对其在细胞外功能的认识越来越多。

其中，外源性CRT在皮肤伤口愈合和多种修复过程中发现新的作用。

局部应用CRT治疗猪皮肤伤口可增加伤口的表皮细胞再生，还可增加内芽组织的生成以及上调一种向生长因子ß3（伤口愈合时的一种关键因子）的转化，还发现巨噬细胞和新表皮的基底角质形成细胞核新真皮细胞增生增加。

同时体外实验也表明，CRT可诱导人初级角质形成细胞，成纤维细胞核微血管内皮细胞多于2倍的细胞增生。

所以，CRT在皮肤伤口修复过程中具有重要的作用。

钙网织蛋白一般使用钙离子作为第二信使在细胞内传递信息，在很多细胞内,钙离子发挥不可替代的作用，尤其是在某些细胞中作为第二信使来传递激素的作用。

细胞内自由的钙离子在心肌细胞中视重要的第二信使。

细胞内钙离子的动态平衡发生改变将对许多细胞功能都有重要的影响，如细胞分泌物，细胞伸缩，细胞运动，机理，蛋白质合成，修改以及折叠，基因表达，细胞循环步骤等。

细胞内钙离子的动态平衡在初始阶段主要通过内质网来维持。

作为对细胞外刺激的反应，钙离子将从内质网内腔中通过钙离子通道释放出来。

这些刺激是通过IP3R和RyRl来作为媒介的，一些细胞外钙离子还可以通过血浆经过细胞膜传递进入细胞内。

进入细胞内的大部分钙离子将在随后通过SER-CA进入到内质网网腔中。

还有一些钙离子则通过细胞膜上的钙离子-ATP酶和钠离子-钙离子交换系统重新回到血浆中。

近年来发现钙网蛋白(calreticulin，CRT)是内质网／肌浆网内主要的钙离子结合蛋白，通过协助蛋白质正确折叠和维持细胞钙离子稳态而参与调节细胞凋亡、黏附、类固醇敏感性基因表达和自身免疫反应等。

缺血／缺氧损伤时钙超载和氧自由基的大量产生诱导细胞凋亡增加。

研究发现H—postC(缺氧后处理,hypoxic postconditioning)可以诱导乳鼠心肌细胞CRT表达上调，并减轻H／R引起的细胞凋亡，提示CRT是后处理细胞保护的重要信号分子。

I-postC(缺血后处理,ischemie posteonditioning)的细胞保护机制涉及钙稳态调节及细胞凋亡抑制，CRT是心肌肌浆网中主要的钙结合蛋白，通过协助蛋白质折叠维持细胞钙稳态等机制参与细胞凋亡调控。

近年来发现，CRT在组织细胞氧化应激和缺血(氧)损伤中具有重要作用，小鼠胰岛素癌MIN6细胞过表达CRT减轻NO诱导的细胞凋亡。

CRT过表达还抑制肾上皮LLC-PK细胞内质网钙离子释放，减轻胞浆钙超载，增强细胞对过氧化氢诱导氧化应激损伤的抵抗力。

发现乳鼠心肌细胞HPC 24 h后胞内CRT表达增加，并减轻后续H／R所引起的心肌细胞凋亡，心肌梗死前24 h进行IPC的大鼠梗死边缘区心肌组织CRT表达上调，与梗死后心功能呈正相关，与梗死面积呈负相关，提示CRT是心肌缺血早期重要的保护因子。

在大鼠骨骼肌I
／R损伤模型和原代培养骨骼肌细胞H／R模型上证实，I／H-postC诱导CRT含量显著增加，提示I／H-postC诱导CRT表达上调．减轻细胞内钙超载和骨骼肌细胞调亡。

I-postC通过上调CRT 表达减轻骨骼肌细胞凋亡的信号通路尚不清楚，钙信号途径是I／R诱导细胞凋亡的关键途径。

RT—PCR 按常规方法制备标本总RNA，用紫外分光光度计测定RNA样本的浓度与纯
度。

取1ul总RNA加入按试剂盒说明书配置的反转录液9ul中至终体积10ul。

反应条件：42℃30min，99℃5 min，5℃5 min，1个循环，逆转录产物4℃保存。

NCX1的PCR是将10ulcDNA产物加入按试剂盒说明书配置的40ul的PCR反应体系中。

例：引物：NCXl上游5'-CATTGGCATCATGGAGGT-3’，下游5’一TTTGCTGGTCAGTGGCTGCTTGTC-3’，预期片断大小403 bp；GAPDH做内对照。

反应条件：94℃2 rain，1个循环；94℃30 s，53℃30 s，72℃90 s，30个循环；72℃10 min。

1个循环；PCR产物4℃保存。

膜联蛋白annexin
膜联蛋白(annexins) 是一类结构相关钙依赖的磷脂结合蛋白超家族, 约占细胞总蛋白的2%.在细胞中参与膜转运及膜表面一系列依赖于钙调蛋白的活动, 包括囊泡运输、胞吐作用中的膜融合,信号传导和钙离子通道的形成、调控炎症反应、细胞分化和细胞骨架蛋白间的相互作用等. 可以分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……等多种类型。

Annexins超家族在结构上具有中心结构域，而这种结构域实质上是由70个氨基酸残基组成的重复序列的保守结构，以钙离子依赖的方式可逆地和细胞膜磷脂结合。

不同的annexin具有独特的N断序列，独特的基因表达方式和组织特异性，这也说明每种annexin蛋白在集体的不同组织和部位执行者不同的生物学功能。

但遗憾的是，每种annexin确切的生理功能尚不十分清楚。

目前annexins超家族已有近20个成员。

不同annexin 蛋白的中心结构域大约有50 %的氨基酸序列同源.。

Annexin 超家族的每个成员都含有一个N 端结构域, 其长度和序列明显不同。

它们都含有钙结合蛋白S100 蛋白家族共有的钙结合位点和磷酸化位点. S100 蛋白是一类能通过与钙离子结合而在体内发挥重要生物学作用的蛋白质.
膜联蛋白 I(annexinⅠ) 是annexins 蛋白超家族中第一个被发现的成员, 是结构相关钙离子依赖的磷脂结合蛋白。

具有annexins 超家族所共有的中心结构域和承担各自独特功能的N 端结构域。

近年来的研究表明, annexinⅠ参与了磷脂囊泡聚集的调控、炎症反应,蛋白酶C的磷酸化底物- 磷脂酶A2(phospholipase A2 , PLA2) 活性的抑制, 细胞信号传导, DNA 修复, 细胞转化, 离子通道形成和细胞凋亡等多种细胞生理过程。

AnnexinⅠ在细胞信号传导方面具有重要功能和作用。

例如，参与调控MAPK/ ERK介导的信号传导，Annexin Ⅰ蛋白具有多个磷酸化位点, 是蛋白激酶C (protein kinase C , PKC) 和酪氨酸蛋白激酶的底物, 其N 端第21 位的Tyr 残基和第27 位的Ser 残基可分别被EGFR 的酪氨酸蛋白激酶和PKC 磷酸化，并且发现发现支气管上皮中annexin Ⅰ蛋白C 端片段中的His 残基被磷酸化,其磷酸化水平受cAMP 和AMP 而不是cGMP 调控。

Annexin Ⅰ可以与生长因子结合蛋白2 (growth factor-binding protein 2 , Grb2) 结合. 而且, 其Tyr残基可以被磷酸化, 这都提示annexinⅠ参与ERK信号级联反应；参与调控cPLA2 介导的信号传导，胞质磷脂酶A2 ( cytosolic phospholipase A2 ,cPLA2) 在细胞内广泛分布,在炎症反应、细胞毒性和有丝分裂发生的信号传导中起重要作用。

annexin Ⅰ可以在体外抑制cPLA2 的活性, 也能有效地抑制培养细胞中cPLA2 的活性。

annexin Ⅰ通过调控cPLA2 的活性来调节细胞内重要生物学过程。

但目前关于annexinⅠ抑制cPLA2 活性的机制还不十分清楚。

annexinⅠ还与炎性反应有关。

annexinⅠ可以抑制许多炎性反应复合物的形成,比较重要
的如PLA2。

PLA2是炎性介质合成释放的关键酶,是调节炎性反应的中心。

annexinⅠ也抑制其他一些参与炎性反应的酶表达和活性,如诱导型一氧化氮合酶和环氧化酶2,而诱导型一氧化氮合酶和环氧化酶2均是已被证实与炎性反应有密切相关的细胞因子。

annexinⅠ在细胞凋亡过程中亦起到关键作用。

annexinⅠ在吞噬细胞对凋亡细胞的识别和吞噬过程中起到阻抑炎性反应、允许凋亡细胞安全清除的作用,提示annexinⅠ在细胞凋亡中作为一个信号转导分子被识别并消化。

annexinⅠ对PLA2具有潜在的抑制作用。

PLA2在调控炎症同时也调节细胞凋亡,其通过释放花生四烯酸,并利用这个通路诱导细胞凋亡；而且, PLA2还可以诱导生成活性氧中间产物进而激活磷酯酶释放诱导凋亡。

某些annexins , 包括annexin Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ和Ⅶ, 能够促进质膜的聚集。

AnnexinⅠ的中心
结构域和N 端结构域都参与了膜的聚集。

力学刺激对软骨细胞的影响
软骨组织由软骨细胞及其分泌的细胞外基质构成，成分简单，细胞获取容易，与多细胞成分的复合组织相比,，构建相对容易。

软骨组织是运动系统的重要组成部分，不同的生物
力学环境直接影响软骨细胞的生长代谢。

虽然体外构建软骨组织目前已有诸多报道，但对于许多具体机制还没有完全认识, 其中包括力学因素对体外培养软骨细胞表型的维持、力学刺激的传导方式、细胞与细胞外基质的信号联系、力学因素对骨髓基质干细胞向软骨细胞分化的诱导作用等。

力学刺激对关节软骨发育、增殖、成熟及基质合成均具有重要作用。

许多动物实验证实适当的力学环境是一个生理性的刺激因素, 可以引导和形成正常的有功能的关节表面软骨。

高度分化的软骨细胞外基质的生物力学性质依赖于两种主要的成分—胶原和的结构和组成, 其中II型胶原占胶原的95%, 而聚合素是蛋白多糖（PG）中的主要成分。

PG、蛋白质及聚合素是软骨组织中重要的化学成分, 对于维持软骨组织的正常结构及功能具有重要意义, 这些成分的含量及化学结构同样受到力学的作用。

持续性低压力作用不改变软骨细胞的合成, 而持续性高压力却可以使之合成减少。

力学刺激可以影响软骨细胞的增殖和合成细胞外基质的功能, 这表明它与细胞间存在着
某种联系。

很多学者认为细胞外基质及细胞膜表面受体分子在力学信号传导过程中具有重要作用, 尤其是膜受体分子如整合素, 在联系细胞和胞外基质过程中具有重要作用。

生物力学刺激可以明显改善构建软骨组织的胶原及蛋白聚糖含量并改善构建组织的力学特性。

但是, 软骨组织在体内的生物力学和生物化学环境是非常复杂的, 对于软骨组织的力学刺激需要什么样的力(如强度、频率及作用时间) 缺乏详细研究，力学刺激的具体机制尚
不清楚。

同时力学刺激是骨生长与重塑的重要参与因素,有关刺激信号在骨细胞的入胞及胞内传导, 则步及整合素、细胞骨架结构、膜离子通道、G蛋白依赖传导途径、磷醋酶G和蛋白激酶C等诸多方面, 并由前列睐素类物质和一氧化氮及它们的调控酶类在其中起重要的中介作用, 这些物质构成复杂的网状结构, 相互影响并构成反馈。

力学刺激在体内外骨组织和细胞中影响的差异是很大的。

在体外对培养的成骨细胞样细胞和骨组织施加较大的拉力刺激, 可引起细胞反应性增殖并表达某些活性物质。

但使用的力学刺激强度, 远远超过3000ue（使骨变形达到0.1%为1000ue）, 甚至达到了可致骨折的25000ue, 而最剧烈的运动在体内造成的刺激也不过3000~4000ue。

在体内, 生理强度范围内的力学刺激可使细胞发生反应, 但细胞对刺激的敏感性存在着差异。

成熟的骨细胞对即使是高强度的拉力刺激也无反应, 而由成骨细胞向骨细胞转化过程中的年轻的骨细胞对刺激的
反应较为敏感。

这提示在骨组织中, 也许只有相对较小的细胞群体担负对力学刺激信号的
“感知”功能, 而其余大部分细胞主要执行“应答”任务。

力学信号在骨骼内的转导通过4个阶段，即力学耦联、生化耦联、信号传递和效应细胞反应，将作用在骨骼上的应力信号转导为生物化学信号。

骨骼细胞中的转导途径有：细胞膜离子通道(特别是牵拉激活的阳离子选择性通道)、与G蛋白耦联的磷脂酶c通路、细胞内钙离子和整合素一细胞骨架等。

有研究证实，整合素一细胞骨架复合体是主要的力学信号转导位点力学刺激信号传至骨细胞所在部位后, 必须为细胞所感知并将其转化为细胞内级联放大的信号流, 才能引起细胞的一系列适应性反应。

这一感知和胞内传导机制虽然尚未被人们完全了解, 但有些化学物质已被确定与这一过程有关, 比如整合素一细胞骨架结构、细胞膜上的离子通道、G蛋白依赖的传导途径、磷脂酶C（PLC）和蛋白激酶C（PKC）等。

钙离子是力学刺激信号传导中重要的第二信使, 在以后的信息传递中起着多方面的作用：①钙离子与PLC分解PIP2产生的另一重要产物二磷酰甘油酯（DAG）共同作用, 可激活PKC。

②钙离子进而与PKC共同作用, 激活磷脂酶A2（PLA2）, 后者可作用于花生四烯酸（AA）而生成前列腺素类物质PGS。

③钙离子可通过激活钙调蛋白而发挥多样的作用。

④钙离子也许可以通过转录因子的作用而引起包括基因eNOS在内的多种基因的表达。

一氧化氮（NO）和PGS也是力学刺激引起的骨适应性反应中的重要中介物。

兔软骨细胞的分离与培养：将出生5～7 天的新西兰兔处死，在无菌操作下从其四肢的关节中取软骨，将软骨切成1～3mm3 大小置无菌试管，PBS 冲洗3 次，1000r/min 离心3 min，吸去PBS，加0.25%胰酶4ml，置5%CO2 培养箱30 min，吸出胰酶后再加入0.2% II 型胶原酶5 ml，置恒温摇床箱内消化6～8h。

观察大部分软骨块被消化后，收集消化液，800r/min离心5min，用培养液洗2 次。

细胞计数后移入25cm2 培养瓶中，使细胞密度为2×104/L，置37℃、5%CO2 培养箱中培养，每2天换液1 次。

原代细胞贴壁并融合成单层后传代培养。

结语
综上所述，力学刺激信号可能由多条途径转导，各途径之间可互相影响。

某些活性物质的自身调节和反馈机制的参与，形成了一个复杂的网状细胞信号转导途径，其具体的作用途径及转导机制有待进一步研究。