玫瑰组织培养及再生方法研究

玫瑰组织培养及再生方法研究

玫瑰（rose）是蔷薇科、蔷薇属直立灌木，是世界上重要的观赏花卉之一，亦是提制香精用于各类高级食品、化妆品的重要原料。常见的有紫玫瑰、红玫瑰、白玫瑰和杂交玫瑰等品种；果实呈球形、卵形或长圆形，红色，萼片宿存。花期5～9月，果期9～10月[9]。玫瑰色、香俱佳，形似皎洁美玉，且浓香诱人，素有花中皇后之称。自古以来玫瑰花就经常作点缀园林，或腌酱、泡露、窨茶、酿酒、入药等加工应用；更有以玫瑰花作妇女装饰、美容和香化用品[6]。玫瑰有效成分的提取起源于古代，最初是为了获得草药医治各种疾病，原始的做法是用水浸渍鲜花，以提取其中的有用成分。

中国是栽培与应用玫瑰花最早的国家之一。玫瑰的繁殖方式很多，常以扦插或嫁接繁殖，但是繁殖率低且病毒感染严重，产量和品质的提高受到很大限制，难以满足规模化生产的需要，但是，研究者们利用组织培养技术为玫瑰的繁殖和新品种的选育提供了新的途径，可以满足规模化生产的需要[4]。主要体现在：[1]

首先，帮助玫瑰快速繁殖。玫瑰有性生殖能力差，大多观赏价值高的品种不形成种子，种子繁殖不现实。而玫瑰实生苗观赏价值较差，因此生产上必须通过野蔷薇扦插再嫁接进行繁殖。这样耗时、耗人力、耗财力，成本高，大规模生产困难。利用组织培养技术可以实现玫瑰优良品种的快速繁殖，并且能保持原有的优良性状不变。

其次，能够获得无病毒植株。玫瑰在生长过程中，可能会感染上数种病毒或类病毒。长期营养繁殖，如扦插、嫁接、分株，不仅不能脱毒，反而使病毒积累，严重影响玫瑰的品质，导致玫瑰观赏价值下降，比如花径变小、色泽变淡、产花减少、斑点较多、花形不规则、易感染病虫等。通过组织培养技术，利用玫瑰茎尖脱毒后，使玫瑰的优良品质得到恢复，花径增大，色泽鲜艳，抗病能力提高，产花数量上升。

再次，可以培育新品种。在组织培养过程中往往会发生芽变，芽变的结果导致花色变异、花的大小变异、花期变异、叶色变异、染色体数量变异等。在组织培养过程中，一旦发生芽变，如果准确切取变异芽，并将其繁殖成完整植株，就可能产生有特殊观赏价值的新品种。

最后，种质资源的保存。玫瑰种质资源丰富，按传统方法保存种质资源占地面积大，且资源易受人为因素和环境因素的破坏而丢失。用组培方法，用极小的空间就可长期有效地保存玫瑰的种质资源。

玫瑰组织培养的方法属于植物组织培养方法，包括培养基的配制、灭菌、接种、培养、驯化移栽等步骤。但在一些过程中也有一些特殊性：

（一）玫瑰的组织培养常用MS培养基、木本植物培养基或B5培养基。培养基中的植物生长调节剂则可根据植物组织的状况调节其用量。如BA 1.0~10mg/L、IAA 0.1~1.0mg/L、GA30.1~20mg/L、NAA0.1~2.5mg/L等。培养基的灭菌一般采取在121温度下高压20~25min。对培养基中所需的维生素等高温下易分解的成分，则用直径为0.2微米的孔状滤膜灭菌。[2]

（二）对于外植体选取。一般而言，在材料休眠末期或萌动前期选取外植体较为有利。从生长在田间或盆栽的优良品种植株上，选取生长健壮、无病虫害的当年生枝条的茎尖和幼茎。取材最好在晴天正午，并且取用植株上部的幼茎。阴雨天或靠近地面的幼茎，表面污染较为严重，难于消毒。在取材前两三～周，最好将母株置于温室内培养，不要给它喷水。玫瑰除用茎尖和幼茎做外植体外，也可以用叶片、叶柄、根、茎、原生质体、胚、花药、子房、花萼和花托做外植体[1]。

然后消毒灭菌，取玫瑰外植体，用5%～10%的次氯酸钠浸泡10～30min或用01%～

02%的HgCl浸泡5～15min。用无菌水清洗7～10次后接种。也可先用75%的酒精浸泡20～30s再采用上述方法消毒。消毒灭菌完毕后，将幼茎切割成05～10cm长的至少带有一个节的切段，接种于培养基中[2]。升汞处理的时间长短对玫瑰茎尖和灭菌效果有较大影响，处理时间过长易使外植褐化甚至死亡，过短影响灭菌效果且污染率高。实验表明以升汞处理5分钟效果最好，灭菌成活率可达80%[4]。

（三）愈伤组织的诱导。将外植体接种于MS+BA 0.2mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖10000mg/L的培养基上，在培养基内培养两周，外植体基部就会长出愈伤组织，之后每一周应转移到新鲜的培养基上一次，以保证愈伤组织体积的增长需求。此时的培养基是不能分化出幼苗的，必须经过分化培养，转移到G+BA 0.1mg/l+NAA 0.2mg/L+LH500mg/L+蔗糖20000mg/L的培养基上培养，愈伤组织由疏松转向致密，继续接种到G+BA 0.4mg/L+NAA0.1mg/L+LH500mg/L+蔗糖35000mg/L的培养基上进行继代培养，每周转移一次，大约四到六周形成胚状体。[8]不同外植体愈伤产生的能力不同，叶为90%，根为70%，节间为55%，花药为19%。

（四）不定芽的诱导根据研究人员对2125个玫瑰侧芽做外植体获得的无菌苗三年间在大田生长情况的调查，没有发现变异植株，这说明侧芽方式繁殖的玫瑰植株性状很稳定。不定芽的诱导就来源于枝条中部的侧芽的繁殖，且侧芽的繁殖速率最快。所以在愈伤组织的基础上诱导出不定芽可能得到更多的无菌外植体和无菌苗。[1] 有研究试验结果说明提高不定芽的诱导有以下几个因素：①在培养基中添加蔗糖有增加丛芽数量的作用；②加入低浓度的GA能进一步改善芽繁殖，95%的外植体能产生7个以上的不定芽。③能提高芽繁殖数量的物质还有月桂酸甲酯、乙烯等。④作为诱导不定芽的需要培养基为MS培养基，在培养基中需要添加低浓度的激素BAP0.3～0.5mg/L，NAA0.004～0.3mg/L或IAA或GA0.0～20mg/L。[1]

（五）增殖培养，玫瑰的增殖培养，一靠无菌苗切段繁殖，二靠诱导不定芽，形成从生苗；三靠愈伤组织形成体细胞胚或原球胚。将已长大的玫瑰嫩茎切成1～2个节的茎段，投入到新鲜的增殖培养基上，5～6周进行一次继代增殖。在外植培养到10～15d 内第一叶片的叶原基伸长，第二叶片叶原基可见；15～20d侧芽伸长；25～30d长度达6～10mm。增殖培养基可用不定芽诱导培养基，如MS+BA03～05+NAA0004～03mg/L。

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（六）壮苗与生根。壮苗培养的培养基为：MS+BA03～05+NAA001～01或MS+BA03～05+IBA03。也可以壮苗为主，增殖为辅，使增殖与壮苗合二为一。玫瑰组培苗增殖与壮苗需光照10～12h，光照强度2000l x，温度24～26℃。玫瑰在组培过程中，其生根能力因品种特性、所用植物材料及培养基成分而有较大差异，许多研究结果表明，玫瑰茎段微繁殖容易生根，使用植物激素IAA，IBA或NAA含量01～05mg/L，蔗糖含量2%～25%的MS培养基有利于玫瑰茎段生根。另外，光照、温度等对玫瑰微繁殖生根也有直接影响。

（七）炼苗和大田移植是玫瑰微繁殖获得成功的最后阶段。组培幼苗由人为培养环境转移到天然环境中，环境条件发生巨大变化，湿度大幅度降低，温度不恒定，光照强烈，微生物多，故需炼苗过渡。一般玫瑰微繁殖炼苗需经过室内三天的取盖炼苗，然后将苗从瓶中取出，洗去根部培养基，定植在珍珠岩、泥炭、或沙土中，用3～5%的多菌灵喷洗。炼苗时要注意基质中的水分含量，水分太少，不能满足苗生长发育；水分太多，导致烂苗。炼苗中、后期要注意通气，给予足够的光照，其幼苗成活率可达80％以上。

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根据相关研究者的研究结果可知，玫瑰组织培养往往易产生污染、褐化、玻璃化等问题。导致这类问题发生的因素很多，但目前普遍将其归为两类，一类是外植体自身带