第一章 分子生物学的基本操作

分子克隆的载体---具备自主复制 能力的DNA分子 （vector），如 病毒、噬菌体和 质粒等小分子量 复制子都可以作 为基因导入的载 体。
1970年Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处理后， 能有效地吸收λ噬菌体DNA。
1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞同样 能够摄取质粒DNA。
核苷酸的连接方式
核苷酸之间以磷酸二
酯键连接形成多核苷
酸链，即核酸。
技术保证2——DNA的体外切割和连接
1962年Arber 发现限制性核酸内切酶，1967Gellert发现了 DNA 连接 酶DNA ligase covalently links two DNA strands
3’
5’
Restriction enzyme
大肠杆菌载体
pBR322结构图
1.5.1 质粒DNA及其分离
细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体并能自主复制 的遗传成份。绝大多数的质粒都是由环形双链DNA组成的复制子， 也有线性质粒的报道。 质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状态，也可 能在一定的条件下被可逆性整合到寄主染色体上，随着染色体的 复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
DNA加样孔
阴极
阳极
大分子量的DNA 移动的慢
小分子量的DNA 移动的快
电泳缓冲液
在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子 化状态的，所以，DNA和RNA多核苷酸链又被称为多聚阴离子 （polyanions），把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电 极的方向迁移。 在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁 移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。
1.3 基因扩增
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)， 即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或 DNA 序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。 基本原理 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其 特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由 高温变性—低温退火—适温延伸三个基本反应步骤构成， 经多个循环，理论上靶DNA分子将呈现指数性扩增。
1.5.2 重要的大肠杆菌质粒载体
1.5.2.1. pSC101质粒载体
pSC101是一种严紧型复制控制的低拷 贝数的大肠杆菌质粒载体，平均每个寄主细 胞仅有1～2个拷贝。其分子大小为9.09kb， 编码有一个四环素抗性基因（tetr）。 pSC101质粒不仅具有可插入外源DNA的 多个限制性核酸内切酶的单克隆位点，而且 还具有四环素抗性的强选择记号，因此，它 被选为第一个真核基因的克隆载体。当然， 这个质粒载体也有其明显的缺点，它是一种 严紧型复制控制的低拷贝质粒，从带有该质 粒的寄主细胞中提取pSC101 DNA，其产量就 要比其它质粒载体低得多。
Herbert Boyer
处于能够接受外源DNA状态的细胞称为感受态细胞。
感受态 细胞制 备及细 菌转化 步骤：
1.将快速生长中的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中， 便会造成细胞膨胀（形成原生质球）。
2.Ca2+与转化混合物中的外源DNA形成粘 附在细胞表面的复合物。 3.立即将该体系转移到42℃下做短暂的 热刺激，复合物便会被细胞所吸收。 4.在全培养基中生长一段时间使转化基 因实现表达、细胞活性恢复。 5. 涂布于选择性培养基中分离转化子。
End of the 1st PCR Cycle –
Results in two copies of target sequence
每完成一个
循环需2～4 分钟， 2～3 小时就能将 待扩目的基 因扩增放大 几百万倍。
Target Amplification
No. of
1 cycle = 2 Amplicon
从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。
1973 - Boyer, Cohen & Chang
Transform E. coli with recombinant plasmid
Kanamycin resistance gene Stanley Cohen & Annie Chan Tetracycline resistance gene
PCR原理示意图
PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95oC)
Target Sequence
Target Sequence
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使 模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链， 以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
No. Amplicon Cycles Copies of Target
2 cycle = 4 Amplicon
1 2 3 4 5
2 4 8 16 32 64 1,048,576
3 cycle = 8 Amplicon
4 cycle = 16 Amplicon
5 cycle = 32 Amplicon
E．coli的质粒种类
1) colE1因子（大肠杆菌素因子）—多数不 能进行接合转移DNA，属高拷贝松弛型。 2) R因子（抗药性因子）
可接合转移DNA，属低拷贝 严紧型， 质粒较大，操作不便
3) F因子（性因子）
质粒载体DNA的分离——碱裂解法
碱裂解法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而 达到分离目的的。 在pH大于12的碱性条件下染色体DNA的氢键断裂双螺旋结构 解开而变性。质粒DNA的氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结 构的两条互补链不会完全分离，当pH恢复至中性时，变性的质 粒DNA又恢复到原来的构型保存在溶液中。而染色体DNA不能复 性而形成缠连的网状结构。通过离心染色体DNA与不稳定的大分 子RNA蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 用酒精沉淀法可以收集仍然滞留在上清液中的质粒DNA。
知识回顾——核酸的化学组成
核酸 （RNA、DNA）
磷酸 核苷酸 核苷
核糖（RNA）
戊糖
脱氧核糖（DNA）
A、G、C、U
碱基
A、G、C、T
戊糖
碱 基
嘌 呤
N 7 8 9 NH 5 4 6 3 N 1N 2
腺 嘌 呤
鸟 嘌 呤
嘧
5 4 6 1 Βιβλιοθήκη BaiduH 3 2
啶
N
尿嘧啶
胞嘧啶
胸腺嘧啶
核 苷
NH2 N N HOCH2 H H OH O H H OH 腺嘌呤核苷 N N N H2N N N HOCH2 O H H H OH H OH OH N HO HOCH2 H H OH O H H OH 胞嘧啶核苷 H OH N N HO HOCH2 H O H H OH 尿嘧啶核苷 NH2 N N OH
基因工程技术区别于其它技术的根本特征：具有 跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于 毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力。
1.1 重组DNA操作的两大技术保证
技术保证1——DNA的核苷酸序列分析技术
DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶学和生物化学的基 础上创立并发站起来的一门重要的DNA技术学，这门技术， 对于从分子水平上研究基因的结构与功能的关系，以及克隆 DNA片断的操作方面，都有着十分广泛的使用价值。
鸟嘌呤核苷
如果是存在于DNA中的脱氧核苷则2’位则是H而不是OH。
磷 酸
+ 戊糖
+ 碱基
=
核苷酸
NH 2 N
O HO O P HO OH
NH2 N O O
-
CH2 CH 2
O O
N
O
N N N H H
OH OH OH OH
O O
-
O O
-
P O
-
P O
-
P O
-
OCH2 H H
O
OH OH 三磷酸腺苷 (AT P )
基本原理
一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的 电极。 电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率， 它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与分 子同介质的摩擦系数成反比。 已知摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数，因此， 根据分子大小的不同、构型或形状的差异以及所带的净电荷的 多寡，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成 分彼此分离开来。
Plasmid pSC101
Transformed cells plated onto medium with kanamycin and tetracycline E. coli transformed with recombinant plasmid
Only cells with recombinant plasmid survive to produce colonies
PCR Cycle - Step 3 -
At 72oC Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated
③引物的延伸： DNA模板--引物结 合物在TaqDNA聚 合酶的作用下，以 dNTP为反应原料， 靶序列为模板，按 碱基配对与半保留 复制原理，合成一 条新的互补 链。
凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关，凝胶 浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔 隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙 就增大，其分辨能力也就随之减弱。
凝胶类型及浓度 分离DNA片段的大小范围（bp）
0.3%琼脂糖
0.7%琼脂糖 1.4%琼脂糖 4.0%聚丙烯酰胺 10.0%聚丙烯酰胺 20.0%聚丙烯酰胺
Ligase
5’
3’
Restriction enzyme Ligase
1.2 细菌转化
仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行 DNA的切割和重组远不能满足基因研究的需要。 DNA片段在体外不具备自我复制能力，要想得到足够量 和足够纯度的DNA，必须将它们连接到具备自主复制能力 的DNA分子上（载体上），并转入寄主细胞中进行繁殖。 这就是基因克隆，或分子克隆 。
6 cycle = 64 Amplicon
6 20
7 cycle = 128 Amplicon
30
1,073,741,824
PCR仪
1.4 核酸的凝胶电泳
自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝 胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技 术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸 相互作用的重要实验手段，也是现在通用的许多分子生物学研 究方法，如： DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析 以及限制酶切作图等的技术基础，受到科学界的高度重视。
第一章 分子生物学的基本操作
分子生物学研究从20世纪中叶开始高速发展的 最主要原因—— 现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和 基因工程技术的进步。
DNA分子的切割与连接 核酸分子杂交 凝胶电泳 基因操作 细胞转化 核酸序列分析 基因的人工合成 基因的定点突变
PCR扩增

基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒 或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之 进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续 稳定的繁殖和表达。
50 000~1 000
20 000~1 000 6 000~300 1 000~100 500~25 50~1
1.5 基因工程载体
基因工程载体是一类可供外源DNA插 入并携其进入适当宿主细胞且能自主 复制的DNA分子。 载体特点 1. 至少有一个复制起点，因而至少 可在一种生物体中自主复制。 2. 至少应有一个克隆位点，以供外 源DNA插入。 3. 至少应有一个遗传标记基因，以 指示载体或重组DNA分子是否 进入宿主细胞 4.安全性
琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之间
电泳操作基本程序
称样
溶解
加热
制板
倒胶
取样
点样
电泳
检测
结果
在紫外线的照射下结合溴化乙锭的DNA 分子发出荧光
检测:溴化乙锭（ethidium bromide，简称EtBr）染色， 紫外观察。
聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶，其分辨范围为1个碱基对到1000个碱基对之间
PCR Cycle - Step 2 – Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences
②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温 度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；