[整理]临床医学检验新技术.

荧光定量PCR

所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

技术原理：将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得CT值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

临床应用：各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价；地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断；遗传基因检测实现遗传病诊断。检测种类涉及多种病原体，从细菌、病毒、衣原体、支原体、真菌、立克次体、螺旋体到寄生虫。

流式细胞术

流式细胞术（FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。

技术原理：将待测细胞经特异性荧光染料染色后放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱，后者与入射的激光束垂直相交，液柱中的细胞被激光激发产生荧光。仪器中一系列光学系统（透镜、光阑、滤片和检测器等）收集荧光、光散射、光吸收或细胞电组抗等信号，计算机系统进行收集、储存、显示并分析被测定的各种信号，对各种指标做出统计分析。

临床应用：可用于白血病的分型、肿瘤细胞染色体的异倍性测定，以及免疫学研究，并已开始用于细菌鉴定，病毒感染细胞的识别和艾滋病感染者T4、T8细胞的记数。

FCM通过荧光抗原抗体检测技术对细胞表面抗原分析，进行细胞分类和亚群分析。这一技术对于人体细胞免疫功能的评估以及各种血液病及肿瘤的诊断和治疗有重要作用。目前FCM用的各种单克隆抗体试剂已经发展到了百余种，可以对各种血细胞和组织细胞的表型进行测定分析。

一、在血液病诊断和治疗中的应用

FCM通过对外周血细胞或骨髓细胞表面抗原和DNA的检测分析，对白血病等各种血液病的诊断、预后判断和治疗起着举足轻重的作用。

二、在血栓与出血性疾病中的应用

FCM可以通过单抗免疫荧光标记(血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa,CD62，CD63等)监测血小板功能及活化情况，有利于血栓栓塞性疾病的诊断和治疗。而用FCM

测定钙离子浓度，可以作为活化血小板监测的非免疫性指标。

FCM可以测定血小板相关抗体含量，用于诊断及治疗监测，具有检测速度快、灵敏度高的优点。

酶联免疫分析技术

酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)技术自20 世纪70年代初问世以来，发展非常迅速，目前被广泛应用于免疫学、医学、生物学等许多领域。ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。

技术原理：酶联免疫吸附试验是一种固相免疫测定技术，其先将抗体或抗原包被到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。测定时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应，后加入酶标抗体与免疫复合物结合，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离的未结合成分，最后加入酶反应底物，根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度(A)值的大小进行定性或定量分析的方法。

根据检测目的和操作步骤不同，有双抗体夹心法、间接法、竞争法三种类型的常用方法。

临床应用：ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。

1、病原体及其抗体的检测病毒感染如肝炎病毒，巨细胞病毒，风疹病毒，疱疹病毒，轮状病毒，艾滋病病毒（HIV）等。细菌感染如链球菌，布氏杆菌等。寄生虫感染如阿米巴、弓形虫、锥虫等。

2、蛋白质如各种免疫球蛋白，肿瘤标志物如甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺碱性磷酸酶，激素如hCG, FSH, TSH, hGH, 酶如肌酸激酶-MB，其他蛋白质如铁蛋白等。

3、非肽类激素如T3, T4，雌二醇，皮质醇等。

4、药物治疗心脏病药物如地高辛，抗哮喘药物如茶碱，抗生素如庆大霉素等。

免疫印迹技术

免疫印迹法 (Western blotting) 是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术

基本原理：免疫印迹与DNA的Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探针检测特异性组分。不同的是，Western blot所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。

临床应用：免疫印迹法具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法，如组织抗原的定性定量检测、多肽分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检测等。用免疫印迹技术可定性、定量地检测出待检样品中含量很低的特定病原体的抗原成分，对于一些能感染细胞而细胞病变不易观察的病原体的检测也很有用。用单克隆抗体做为第一抗体进行免疫印迹，还可以对毒株做分型研究。

时间分辨荧光分析法

时间分辨荧光分析法（Time resolved fluoroisnmuno assay,TRFIA）是近十年发展起来的非同位素免疫分析技术，是目前最先进的免疫检测技术。

技术原理：使用三价稀土离子（如Eu3+、Tb3+、Sm3+、Dy3+）作为示踪物，通过这些稀土离子与具有双功能结构的螯合剂以及抗原形成稀土离子-螯合剂-抗原螯合物。当标记抗原、待测抗原共同竞争抗体，形成免疫复合物，由于免疫复合物中抗原抗体结合部分就含有稀土离子，当采取一些办法将结合部分与游离部分分开后，利用时间分辨荧光分析仪，即可测定复合物中的稀土离子发射的荧光强度，从而确定待测抗原的量。

正常情况下，免疫复合物中的稀土离子自身荧光信号很微弱，若加入一种酸性增强液，稀土离子从免疫复合物中解离出来，和增强液中的β-二酮体、三正辛基氧化膦、Triton X-100等成分形成一种微囊。后者被激发光激发后，则稀土离子可以发出长寿命的极强的荧光信号，使原来微弱的荧光信号增强将近100万倍。

采用时间分辨技术测量荧光，采用了门控技术，它是使背景荧光信号降低到零以后，再测定长寿命标记物的荧光。

临床应用：时间分辨荧光免疫分析可用来检测生物活性物质。在内分泌激素的检测，肿瘤标志物的检测，抗体检测，病毒抗原分析，药物代谢分析以及各种体内或外源性超微量物质的分析中，应用TRFIA法越来越普遍。近年来，已将这项技术应用于核酸探针分析和细胞活性分析、生物大分子分析，发展十分迅速。

一、TRFIA法在内分泌学中的应用

内分泌激素是一些活性小分子，它们能与适当的抗体反应，具有免疫反应性，但不能产生抗体，不具有免疫原性，它们属于半抗原。对这些半抗原的测定，一般多用竞争性时间分辨荧光免疫法测定。这方面的测定主要有血清中孕酮、雌二醇、睾酮、甲状腺激素、前列腺素的测定等等。

二、TRFIA在肿瘤学中的应用

对一些完全抗原，它们大多是既有免疫反应性又有免疫原性的蛋白质类，主要包括促甲状腺激素、血清胰岛素、血清癌胚抗原、血清甲胎蛋白、乙型肝炎表面抗原等，主要采用非竞争性TRFIA法进行测定。

三、TRFIA法在免疫学中的应用

某些免疫细胞（如NK、LAK、T杀伤细胞等）的活性，可以用TRFIA法来检测。

四、TRFIA法在微生物学中的应用

目前TRFIA已广泛应用于乙型肝炎病毒、脑炎病毒、流感病毒、呼吸道合胞体病毒（RSV）、副粘病毒、风疹病毒、马铃薯病毒、轮状病毒、人类免疫缺陷病毒（HIV）、出血热病毒和梅毒螺旋体的抗原抗体以及某些细菌和寄生虫抗体的检测。最近,潘利华等用TRFIA法进行了人血清中丙型肝炎病毒抗体(Anti-HCV)的检测，效果明显高于酶联免疫法。