醋酸菌菌种分离筛选方法
醋酸菌菌种分离筛选方法
醋酸菌菌种分离筛选方法醋酸菌的细胞为椭圆至杆状，单个成双或成链，鞭毛周生或端生，运动或不运动，革兰氏阴性菌，好氧菌，一般在乙醇或其他可氧化物的酵母煮液或酵母消化液培养基生长旺盛。
醋酸的钠盐和钙盐与三氯化铁共热，生成红褐色沉淀，原液变成无色。
可进行分离菌鉴别。
1.培养基：1.1米曲汁乙醇碳酸钙培养基：米曲汁（10-12BX）1000mlCaCO310-15g95℅乙醇30-40ml（灭菌后加入）PH自然1.2葡萄糖碳酸钙培养基：葡萄糖15g/L酵母膏10g/L CaCO315g/LPH 6.81.3乙醇30mL/L酵母膏10g/L葡萄糖10g/L CaCO310-15g/L（常规筛选培养基）PH 6.8-7.0注：常规培养基中的碳酸钙易沉淀，平板不易观察到透明圈，选择米曲汁乙醇碳酸钙培养基为好。
1.4醋酸菌保存培养基：酵母膏15g/L葡萄糖10g/L CaCO315-20g/L琼脂15-20 g/L 3-4滴乙醇/试管。
1.5液体种子和发酵培养基：乙醇30-35mL/L膏酵母10g/葡萄糖10g/L KH2PO40.5g/L MgSO40.5g/L PH 6.5-6.82.菌种筛选：2.1集菌：1-2g（5ml）样品，在无菌下加入30-50ml/250ml米曲汁乙醇液体培养基（0.5ml 0.02℅结晶紫醋酸溶液/100ml培养液）中，130-33℃震荡培养24-48h，集菌液PH明显下降，有醋味，镜检细胞革兰氏染色阴性。
形态与醋酸菌相符即可分离。
2.2混菌法分离：（分离及初筛）适度稀释10-5、10-6、10-7取1.0ml菌液置于无菌平板或涂布中，每个梯度平行两次，米曲汁乙醇碳酸钙培养基倒平板，30℃24-48h，观察有小菌落出现，菌落周围形成透明圈，圈的大小因菌而异。
挑透明圈出现早且菌落丰厚，边缘整齐，生长旺盛不同的菌落转接于曲汁乙醇碳酸钙斜面，30-33℃24-48h。
根据菌落周围溶解透明圈大小初步筛选出产酸高的菌种。
醋酸菌分离及鉴定
醋酸菌分离及鉴定一、培养基1、分离培养基（溴甲酚紫显色平板）:葡萄糖1%、酵母膏1%、无水乙醇3%（体积分数）、0.04%溴甲酚紫5%（体积分数）、琼脂1.8%、水100 mL，0.1 Mpa 灭菌20 min，无水乙醇在灭菌后培养基温度降到75 ℃左右时加入。
2 、保藏培养基: 葡萄糖1%、酵母膏0.5%、琼脂2%、丙三醇2.5%（体积分数）、水100 mL，121℃灭菌20 min 备用。
3、液体培养基:葡萄糖1%、酵母膏0.5%、丙三醇2.5%（体积分数）、水100 mL，调节pH 至6.30，121 ℃灭菌20 min 备用。
二、醋酸菌分离纯化流程样品→醋酸菌发酵液中富集培养→稀释分离→纯化→斜面试管保藏→产醋酸定性测试。
三、步骤1 、菌株分离取1g 醋醅样品置入无菌试管，装入9 mL 无菌水，振荡均匀后得到10-1 的稀释液，之后10 倍梯度稀释直到10-6 稀释度。
取10-2至10-6 稀释度的样品稀释液分别涂布溴甲酚紫显色平板，每个稀释度涂布2 个平板，每个平板涂布0.2 mL 的样品稀释液，涂布完成后30 ℃倒置培养48 h左右。
选取菌落数在30~50 个左右的平板，挑取该平板上的所有单菌落转入斜面保藏培养基中，30 ℃培养24 h 左右后保存于4 ℃冰箱。
2 、菌株纯化将试管斜面中的菌株平板划线分离后再转接试管斜面，4℃冰箱保存。
3、菌株归类以上述各菌株划线分离的平板为基准，将形成菌落极其相似的菌株归为一大类。
4 、菌悬液的制备用接种环挑取新鲜培养的斜面菌株半环，溶于装有200 μL 无菌超纯水的Eppendorf 管中，于试管振荡器上混匀后得到菌悬液。
四、鉴定1、菌株形态特征:镜下细胞呈短杆状,革兰阴性,无芽胞,单个或成对、成链排列,个体大小为（0.5～0. 7)μm ×(1. 0～1. 5)μm。
2、培养特征:在葡萄糖、酵母膏、乙醇、CaCO3平板培养基上生长旺盛,菌落圆形、油脂状,表面光滑、凸起,边缘整齐,培养2 d能产酸,使CaCO3 溶解形成透明圈,继续培养将乙酸氧化分解产生CO2 和水,菌落周围出现白色透明圈。
醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究
第2章醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究2.1引言醋酸菌包括醋酸杆菌属和醋酸单胞菌属[30]，又名醋酸细菌。
醋酸菌的细胞一般为杆状、直或者稍弯，也有少部分像椭圆形，由单个、成对或者成链状排列的，大小一般在0.6～0.8×1.0～3.0 μm。
醋酸菌没有芽胞是革兰氏阴性菌，它有的细胞是周生鞭毛种类，一般在液面上生长会形成较厚的菌膜。
黑色醋酸杆菌等为另一些种类的醋酸菌细胞是端生鞭毛。
醋酸菌的分布广泛，在未灭菌的醋、啤酒、黄酒中果酒，以及在果园的土壤中、葡萄或酸败食物表面中都有生长[31]。
醋酸菌是酿醋过程中不可缺少的。
醋酸菌在发酵过程中，会产生大量的醋酸和其他有机酸，而且还有醇类[32]。
本章节研究醋酸菌的分离鉴定和发酵条件，通过平板分离、革兰氏染色、产醋酸实验，并经生理生化鉴定和查阅伯杰氏手册，做出进一步鉴定。
2.2实验材料与方法2.2.1材料与仪器分离样品：取自湖北某果醋厂发酵的醋醅。
试验主要仪器设备型号及产地如表2.2.1.a。
表2.2.1.a主要仪器设备Tab 2.2.1.a Main instrument equipment主要仪器型号厂家生化培养箱双目生物显微镜分析天平手提式不锈钢蒸汽灭菌锅超净工作台精密数字式酸度计PYX-250S-ABME（BA/E3）BS224SDSX-280BSW-CJ-1FDpHS-3C长沙科技科力仪器德国莱卡北京化丰上海南鹏上海科技试验试剂：葡萄糖、酵母膏、甘油、无水乙醇(95%)、CaCO3、(NH4)2SO4、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeCl3、乙酸钙、乳酸钙、浓硫酸均为分析纯；琼脂食用级。
2.2.2培养基[33-37]表2.2.1.ｂ培养基成分表Tab 2.2.1.ｂMedium composition名称葡萄糖酵母膏无水乙醇(v/v)琼脂CaCO3备注⑴基础发酵培养基1%1%3%pH 4. 5⑵分离培养1%1%3%2%2%pH自然⑶斜面保藏培养基1%1%3%2%1%pH自然⑷液体保藏培养基1%1%1%pH自然⑸改进后的斜面液体保藏培养基1%1%3%2%1%pH自然⑹发酵培养基1%1%7%pH 4. 5⑺Horyer-Frateur培养基3%pH自然⑻GYC培养基10%5%2% 2. 5%pH自然⑼高糖培养基30%1%2%2%pH自然⑽生酮培养基3%2%甘油3%⑾产5-酮基葡萄糖酸盐培养基3%1%2%2%pH自然⑿氧化乙酸培养基1% 1% 2% 乙酸钙1% pH7.2⒀氧化乳酸培养基1% 1% 2% 乳酸钙2% pH7.0-7.2⒁乙醇培养基1% 3% 2% pH自然注：培养基⑸在斜面保藏培养基⑵上，30℃培养24 h，加入无菌碳酸钙，灌入并液体培养基到斜面上，至离管口2cm处，密封冷藏；培养基⑺其他成分有(NH4)2SO40.1%，K2HPO40.1%，KH2PO40. 01%，0.025%，FeCl30. 0005%；以上培养基均以121℃灭菌20 min。
醋酸菌菌种分离筛选方法
醋酸菌菌种分离筛选方法醋酸菌是一类常见于自然界中的微生物，主要分布于果酱、蜂蜜、果汁等酸性环境中。
醋酸菌能够利用酒精和氧气生成乙酸作为能量源，在食品加工、饮料发酵以及环境保护中具有重要的应用价值。
为了获得高效的醋酸菌菌种，需要进行菌种的分离筛选。
以下是醋酸菌菌种分离筛选方法的一般步骤：1.样品的收集与处理：从酸性环境中收集样品，如水果糖浆、果酱、蜂蜜等。
样品应保持新鲜，并避免污染。
如果样品是固体的，可以通过混合样品和生理盐水来制备悬浮液。
2.菌落计数：将悬浮液经过适当稀释，并均匀分布在含有固体培养基的琼脂平板上。
用细菌计数板或细胞计数器对菌落进行计数。
选取外形典型的菌落进行进一步的分离。
3.菌种分离：根据菌落形态、色素沉积、生理特性等进行分离。
选取外形典型的菌落，利用无菌环针在无菌琼脂平板上进行涂布。
4.筛选培养基的选择：醋酸菌是革兰氏阴性菌，最适生长温度一般在30-35°C范围内。
常用的筛选培养基包括葡萄糖琼脂葡萄糖琼脂（GAC）和醋酸葡萄糖琼脂（GAA）。
也可以根据菌种特性选择适宜的培养基进行筛选。
5.培养条件控制：将分离出的菌种接种在含有适宜营养物质的筛选培养基上，并控制培养条件。
包括温度、pH值、搅拌速度等。
优化培养条件可以提高菌种的产量和质量。
6.菌种纯化：逐步单菌分离并培养，目的是获得纯种菌株，确保菌株的纯度和稳定性。
7.菌种特性分析：对分离出的菌种进行鉴定和特性分析，包括形态学观察、生理特性鉴定、生化指标检测和分子生物学方法确定其种属和亲缘关系等。
总结：醋酸菌菌种的分离筛选是一个多步骤的过程，需要进行样品收集、菌落计数、菌种分离、筛选培养基的选择、培养条件控制、菌种纯化以及菌种的特性分析。
通过这些步骤的实施，可以获得高效的醋酸菌菌种，为醋酸菌的应用提供有力的支持。
杏皮渣醋酸发酵醋酸菌的分离筛选和鉴定
杏皮渣醋酸发酵醋酸菌的分离筛选和鉴定吴越;张富县;艾乃吐拉·马合木提;傅力【摘要】[目的]筛选获得适宜杏皮渣醋发酵的醋酸菌并对其进行鉴定,为杏皮渣醋质量及产量的提高奠定基础.[方法]在杏皮渣汁自然发酵液、固态发酵醋醅和杏园的土壤中分离醋酸菌,对分离菌株进行产酸曲线的测定及生理生化鉴定,对产酸量高的菌株进行16S rDNA序列测定并建立系统发育树,对其进行鉴定.[结果]共分离得到6株菌,其中Ac01、Ac02、Cp01、Cp02和Tr01属于醋酸菌属.初步判定,在杏皮渣汁的自然发酵液中分离的Ac01和Ac02可能属于醋化醋杆菌(Acetobacter aceti),菌株Ac02醋酸产量在分离菌株中最高,可达到3.04 g/100 mL,其16S rDNA序列与Acetobacter pomorum strain LMG 18848 16S rDNA序列相似度大于99％.[结论]在杏皮渣汁自然发酵液中分离得到的菌株Ac02为醋杆菌属(Acaobacter)的Acetobacter pomorum strain LMG 18848,是一株在杏皮渣醋生产中有应用潜力的醋酸菌.%[Objective] The aim of this study was to screen and identify the acetic acid bacteria strain for brewing vinegar from apricot dregs and lay the foundation for the improvement of the quality and yield of apricot dregs vinegar.[Method] The acetic acid bacteria were isolated from the natural fermentation broth of apricot dregs juice,the solid fermentative substrate of vinegar and the orchard soil,the curve of acid production was measured and the experiments of biochemical identification of each selected strain were conducted.The strains which could produce the highest acid were identified by 16S rDNA sequence and by the phylogenetic tree.[Result] Six strains wereisolated,Ac01,Ac02,Cp01,Cp02 and Tr01 were identified asAcetobacter.Ac01 and Ac02 separated from the natural fermentation broth of apricot dregs juice may belong to Acetobacter aceti after the preliminary determination,the acetic acid yield of the strain Ac02 can reach 3.04 g/100 mL.The similarity of 16S rDNA sequence is more than 99％between Ac02 and Acetobacter pomorum strain LMG 18848.[Conclusion] The strain Ac02 from the natural fermentation broth of apricot dregs juice was identified as Acetobacter pomorum strain LMG 18848.It is a potential application of acetic acid bacteria in brewing vinegar from apricot dregs.【期刊名称】《新疆农业科学》【年(卷),期】2013(050)007【总页数】7页(P1297-1303)【关键词】杏皮渣;醋酸菌;分离;16S rDNA;鉴定【作者】吴越;张富县;艾乃吐拉·马合木提;傅力【作者单位】新疆农业大学食品科学与药学学院,乌鲁木齐830052;新疆农业大学食品科学与药学学院,乌鲁木齐830052;新疆农业大学食品科学与药学学院,乌鲁木齐830052;韩山师范学院生物系,广东潮州521041【正文语种】中文【中图分类】S662.2;S188+.40 引言【研究意义】新疆是全国较大的浓缩杏浆生产基地，2011年新疆杏浓缩浆产量已达约4.53×104t。
菠萝皮渣中醋酸菌的分离与筛选
摘要：以菠萝皮渣为样品，采用碳酸钙平板培养基分离，通过观察透明圈，革兰氏染色与产醋酸定性试验，筛选出2株优良醋酸菌。
对筛选得到的目的菌株进行产酸定性试验、细菌形态学观察、生理生化鉴定，结果表明为醋酸杆菌属，分别标记为B3和B4。
在32℃下以转速150r/min恒温振荡条件下培养并测定B3和B4产酸量和生长量，结果表明B3，B4在发酵84h时产醋酸量最高，分别为1.12g/L（p<0.05）和1.2g/L（p<0.01）。
对其生长量进行比色法测定，表明B3在培养16h（p<0.05）后进入生长稳定期，B4在培养19h（p<0.01）后进入稳定期。
关键词：菠萝皮渣；醋酸菌；分离；筛选中图分类号：TS264.22文献标志码：A doi：10.16693/ki.1671-9646（X）.2020.11.005（College of Agriculture and Forestry，Longdong University，Qingyang，Gansu745000，China）Isolated acetic acid bacteria with CaCO3-plate in pineapple bran，comparing of the transparent circle，Granmstain and acid qualitative tests to screening2strains which had high acetic acied output.It was proved that the strains were acetic acid by the methods of bacterial morphological observation and biochemistry analysis.The propionic acid output and growth of screened strains marked B3and B4were cultured in32℃150r/min were up to1.12g/L and1.2g/L respectively after culture during of84h.The result of biomass determination indicated that B3and B4were up to stable growth period when the culture during was16h and19h respectively.pineapple residue；acetic acid bacteria；isolation；screen菠萝皮渣中醋酸菌的分离与筛选宋曦，汪慧，王应强，张亚亚（陇东学院农林科技学院，甘肃庆阳745000）收稿日期：2020-04-24基金项目：陇东学院青年科技创新项目（XYZK1509）。
新疆酿酒葡萄表皮醋酸菌的分离鉴定及产酸条件优化
新疆酿酒葡萄表皮醋酸菌的分离鉴定及产酸条件优化姜蕾;王斌;肖婧;程卫东;史学伟【摘要】以新疆产区的赤霞珠酿酒葡萄为材料,采用稀释平板法分离得到5株醋酸菌,16S rDNA测序结果表明K1、K-2、K-3属于Acetobacter peroxydans(过氧化醋杆菌),K-4属于Acetobacter oeni(葡萄酒醋酸杆菌),K-5属于Gluconobacter albidus(白葡糖杆菌).选取以上5株醋酸菌进行7天发酵试验,结果表明K-4菌株产酸能力最高.通过单因素试验及正交试验设计对K-4菌株进行产酸培养基优化,结果表明K-4菌株最佳产酸条件为1.5％酵母膏、1.5％葡萄糖、6％无水乙醇.【期刊名称】《中国调味品》【年(卷),期】2019(044)004【总页数】5页(P75-79)【关键词】酿酒葡萄;醋酸菌;产酸特性【作者】姜蕾;王斌;肖婧;程卫东;史学伟【作者单位】石河子大学食品学院,新疆石河子832000;石河子大学食品学院,新疆石河子832000;石河子大学信息科学与技术学院,新疆石河子832000;石河子大学食品学院,新疆石河子832000;石河子大学食品学院,新疆石河子832000【正文语种】中文【中图分类】TS261.1新疆地大物博，气候独特，瓜果品种多、种植面积大、糖度极高、品质优良，但由于加工和销路的问题，每年产生大量的废渣和残次果，造成严重的经济损失。
果醋是一种以果蔬或其下脚料为主要原料，通过酒精发酵和醋酸发酵而成的具有多种营养成分和保健功能的液态食品[1,2]。
因此，发展新疆特色果醋能够快速、有效地解决新疆果品加工废渣及残次果经济损失的问题。
醋酸菌种是决定果醋产量和质量的主要因素之一。
目前，果醋酿造的优良菌株分为醋酸杆菌属(Acetobacter)和葡糖杆菌属(Gluconobacter)2个属。
常用的酿造用醋酸菌还有奥尔兰醋杆菌(A. orleanense)、许氏醋杆菌(A. schuegenbachii)、产醋醋酸杆菌(A. acetigenum)、弯曲醋杆菌(A. curvum)、纹膜醋杆菌(A. aceti)、恶臭醋酸杆菌(A. rancens)、攀膜醋杆菌(A. ascendans)、胶膜醋杆菌(A.xylinum)等[3,4]。
苹果醋发酵用醋酸杆菌的筛选与鉴定
苹果醋发酵用醋酸杆菌的筛选与鉴定李华敏;李林;黄萍萍;刘文丽;潘敏;庄若茹【摘要】近年来,苹果醋逐渐兴起,但是目前用于苹果醋生产的醋酸菌还存在着各种各样的不足,因此有必要进一步筛选产酸性能好、适应苹果醋发酵的醋酸菌.该研究从自然发酵的苹果醋和苹果园土壤中筛选到19株醋酸菌,菌株YT06,YT10,YT12,YT14和YT17的产酸能力较好,在乙醇浓度为6％时产酸量最大,其中菌株YT17在第8天时产酸量达到27.91 g/L;对这5株菌进行分子生物学鉴定,发现按照亲缘关系分属于3个种:桃醋酸杆菌(Acetobacter persici):YT06;苹果醋杆菌(Acetobacter malorum):YT12,YT14;芝庇侬醋杆菌(Acetobacter cibinongensis):YT10,YT17.【期刊名称】《中国调味品》【年(卷),期】2018(043)010【总页数】5页(P22-25,36)【关键词】醋酸杆菌;苹果醋;筛选;鉴定【作者】李华敏;李林;黄萍萍;刘文丽;潘敏;庄若茹【作者单位】鲁东大学食品工程学院,山东烟台 264025;烟台市粮油质量检测中心,山东烟台 265301;鲁东大学食品工程学院,山东烟台 264025;鲁东大学食品工程学院,山东烟台 264025;鲁东大学食品工程学院,山东烟台 264025;鲁东大学食品工程学院,山东烟台 264025【正文语种】中文【中图分类】TS264.22果醋是以水果(包括苹果、葡萄、梨、猕猴桃、柑橘、柿子等)为主要原料，利用酵母菌和醋酸杆菌二次发酵酿制而成的一种营养丰富、风味优良的酸味调味品，其兼具水果和食醋的营养保健性能，有着巨大的市场潜力[1-3]。
在众多果醋中，苹果醋具有苹果果香，因其富含醋酸、苹果酸、琥珀酸和氨基酸等而使醋的风味独特、酸味适度，同时苹果资源丰富，苹果醋生产工艺简单，使其成为市场占有率最高的果醋产品[4-7]。
苹果醋高产醋酸菌的筛选
酵母膏ｌｇ、葡萄糖１ｇ、ＣａＣ０３０．５９、食用酒精 ２ｍｌ、琼月旨２９。
在ｌｋｇ／ｅｍ２压力下灭菌３０ｒａｉｎ，ＣａＣ０３和酒精 灭菌后加入。 １．３试验方法闻
采样—◆驯化分离培养—◆挑选单个菌落—◆试管发酵筛选—◆ 三角瓶发酵筛选培养—◆测产酸率—◆筛选产酸高的菌株—◆分类 鉴定
２结果与分析
２．１富集培养 苹果汁经酒精发酵后，加入；ｉ写ｆａ．ｒ子１４３团｜ｌ蟹
6.期刊论文 何志刚.李维新.林晓姿.任香芸.杨菁.陆东和.He Zhigang.Li Weixin.Lin Xiaozi.Ren Xiangyun.
yang Jing.Lu Donghe 枇杷酒醋化过程醋酸菌的生长、产酸及耗氧的关系 -食品与发酵工业2008,34(12)
以枇杷果酒为原料,以沪酿1.01为发酵菌,研究了枇杷果醋酿造过程中菌株生长、产酸及耗氧的关系.结果表明,枇杷果醋发酵过程中菌株的生长可分 为低菌量的对数增长期、醋化缓冲期、高菌量对数增长期和衰减期4个时期;高菌量对数增长期为主要产酸期,总酸含量与菌量的增长对数值呈线性相关 ;耗氧水平同产酸率、总酸含量与产酸率的交互项呈显著相关;影响耗氧水平的主要因素为产酸率,同时基质中总酸量越大,产酸所需的耗氧水平越高.
３结果与讨论
３．１通过对野生醋酸菌经一系列纯化分离、驯化 培养及扩大发酵筛选。结合品评及各项性能测试。 从３０株野生醋酸菌中选育出２株较优自选醋酸菌２ 号和６号。根据实验结果这２株醋酸菌符合醋酸细 菌属的特征。属于巴氏醋酸细菌巴氏变种（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ
醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究
醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究第2章醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究2.1引⾔醋酸菌包括醋酸杆菌属和醋酸单胞菌属［30］，⼜名醋酸细菌。
醋酸菌的细胞⼀般为杆状、直或者稍弯，也有少部分像椭圆形，由单个、成对或者成链状排列的，⼤⼩⼀般在0.6?0.8 X.0?3.0 ym。
醋酸菌没有芽胞是⾰兰⽒阴性菌，它有的细胞是周⽣鞭⽑种类，⼀般在液⾯上⽣长会形成较厚的菌膜。
⿊⾊醋酸杆菌等为另⼀些种类的醋酸菌细胞是端⽣鞭⽑。
醋酸菌的分布⼴泛，在未灭菌的醋、啤酒、黄酒中果酒，以及在果园的⼟壤中、葡萄或酸败⾷物表⾯中都有⽣长［31］。
醋酸菌是酿醋过程中不可缺少的。
醋酸菌在发酵过程中，会产⽣⼤量的醋酸和其他有机酸，⽽且还有醇类［32］。
本章节研究醋酸菌的分离鉴定和发酵条件，通过平板分离、⾰兰⽒染⾊、产醋酸实验，并经⽣理⽣化鉴定和查阅伯杰⽒⼿册，做出进⼀步鉴定。
2.2实验材料与⽅法2.2.1材料与仪器分离样品：取⾃湖北某果醋⼚发酵的醋醅。
试验主要仪器设备型号及产地如表2.2.1a表2.2.1.a主要仪器设备Tab 2.2.1.a Main instrument equipment主要仪器型号⼚家⽣化培养箱PYX-250S-A长沙科技双⽬⽣物显微镜BME (BA/E3 ) 科⼒仪器分析天平BS224S德国来卡⼿提式不锈钢蒸汽灭菌锅DSX-280B北京化丰超净⼯作台SW-CJ-1FD上海南鹏精密数⼦式酸度计PHS-3C上海科技试验试剂：葡萄糖、酵母膏、⽢油、⽆⽔⼄醇（95%）、CaC03、（NH4）2SO4、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4 7H2O、FeCb、⼄酸钙、乳酸钙、浓硫酸均为分析纯；琼脂⾷⽤级。
2.2.2 培养基[33-37]表2.2.1. b培养基成分表Tab 2.2.1. b Medium composition名称踰糖酵母膏⽆⽔⼄醇（v/v）琼脂CaCO3备注⑴基础发酵培养基1%1%3%pH 4. 5⑵分离培养1%1%3%2%2%pH⾃然⑶斜⾯保藏培养基1%1%3%2%1%pH⾃然⑷液体保臧培养基1%1%1%pH⾃然改进后的斜⾯液体⑸保臧培养基1%1%3%2%1%pH⾃然⑹发酵培养基1%1%7%pH 4. 5Horyer-Frateur 培养⑺基3%pH⾃然⑻GYC 培养基10%5%2% 2. 5%pH⾃然⑼冋糖培养基30%1%2%2%pH⾃然⑽⽣酮培养基3%2%⽢油3%产5-酮基葡萄糖酸(11) ⼟⼘拉K⽢^培⼝养基3%1%2%2%pH⾃然(12)i\7亦公* -H-"1%1%2%⼄酸钙1% pH 氧化⼄酸培养基7.2乳酸钙2%(13) 氧化乳酸培养基1%1%2%pH7.0-7.2⼄醇培养基1%3%2%pH⾃然注：培养基⑸在斜⾯保藏培养基⑵上，30 C培养24 h，加⼊⽆菌碳酸钙，灌⼊并液体培养基到斜⾯上，⾄离管⼝2cm处，密封冷藏；培养基⑺其他成分有（NH4）2SO40.1% , K2HPO40.1% , KH2PO40. 01% , 0.025% , FeCb0. 0005% ;以上培养基均以121C 灭菌20 min。
微生物实验设计-醋酸菌
微生物实验设计-醋酸菌实验设计：醋酸菌的分离与纯化——生物科学2班秦琬莹辛吉瑀张博文一、实验目的学习醋酸菌的分离纯化、鉴定的原理。
掌握平板表面涂布法、平板划线法的分离技术。
二.实验原理1.菌种的分离纯化从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。
2.接种操作方法涂布平板法：因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。
平板划线法：最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。
划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。
3. 结晶紫结晶紫是一种碱性染料，也一种极佳的精密酸指示剂，pH 0.5(绿)～2.0(蓝)~弱酸（蓝紫）~中性（紫色）~碱性（赭红色）；所以在醋酸菌分离纯化平板培养基中加入少量的结晶紫溶液，既不会影响醋酸菌的生长，又可根据变色圈的大小很快把产酸高的醋酸菌株分离出来。
二、材料、用品1.样品：食醋2.培养基：（1）分离纯化平板培养基葡萄糖1 g，酵母膏1 g，碳酸钙2 g，琼脂2g，水100mL，121℃灭菌20min，冷却至70℃加入4mL无水乙醇和0.5mL 0.02％结晶紫冰醋酸溶液。
（2）液态发酵培养基葡萄糖l g，酵母膏1.5 g，磷酸二氢钾0.05 g，硫酸镁0.05 g，水100 mL，pH6.5，灭菌后冷却至60 ℃以下加入无水乙醇3.5mL。
3.器材：接种环、冰箱、试管、培养皿、无菌玻璃涂棒、移液管、恒温培养箱、无菌操作台、高压灭菌锅等。
醋酸菌筛选与利用技术
醋酸菌筛选与利用技术醋酸菌是一种广泛存在于自然界中的微生物，它可以利用氧化有机物来产生酸性物质，这种酸性物质就是我们常说的醋酸。
醋酸有着广泛的应用场景，包括食品加工、制药、石油化工等。
因此，醋酸菌的筛选和利用技术就显得尤为重要。
一、醋酸菌的种类和筛选方法目前已知的醋酸菌有很多种，常见的有杆菌属、乳杆菌属、念珠菌属等。
对于醋酸菌的筛选，主要有两种方法：传统的分离筛选法和基因工程筛选法。
传统的分离筛选法是将样品中的醋酸菌分离出来，再通过对其生长特性、代谢物产生能力以及形态学特征的观察和分析来鉴定其种类。
这种方法相对简单，但是时间和效率都比较低。
基因工程筛选法则是将醋酸菌的筛选过程转移到基因水平，通过基因组学、代谢组学等新技术，可以筛选出生长速度较快、产醋酸能力较强、抗逆性较好的醋酸菌。
这种方法具有高效、精准、可定制化等优点，因此在近年来的应用中越来越受到广泛关注。
二、醋酸菌的利用技术醋酸是醋酸菌代谢产物中最重要的一种物质，也是醋酸菌最重要的应用来源。
醋酸的主要用途有以下几个方面：1. 食品加工醋酸可以用作酸味剂和调味料，例如，生菜等蔬菜中加入适量的醋酸可以提高味道，增加食欲。
此外，面包、蛋糕等食品的腌制和发酵过程也需要加入适量的醋酸以达到更好的质量和口感。
2. 制药醋酸可以用于制药工业中，例如，醋酸钠可以用作药物的溶剂，醋酸氢钠可以用作制药中间体，醋酸乙酯可以用作药物的保留剂等。
3. 衣物染色在古代，醋酸被广泛用于衣物染色，以改变衣物的颜色或者增加衣物的韧性，如今，醋酸还被用于加速染色过程，提高染色质量。
4. 石油化工醋酸可以作为某些酸化剂、溶剂以及塑料助剂，用来促进石油的加工和化学反应。
三、醋酸菌的发酵工艺醋酸菌的发酵工艺主要有两种，即生产型发酵和回收型发酵。
生产型发酵是将醋酸菌种植到发酵罐中，添加营养物质和氧气，在适宜的条件下进行发酵。
这种方式生产的醋酸纯度高，味道好，但是产量较低，成本较高。
回收型发酵是将醋酸硬脆粉添加到大葱水中，与醋酸菌进行回收型发酵。
优良醋酸菌的分离纯化
衰１结晶紫溶液的呈色情况裹
Ｔ＿ｂｋｌ ｍ衄棚ｍＩ雌ｃ山ｒ酣瑚岫乜ｂｋ ０ｆ霉即廿蚰ｖ｜ｏｍ 帅●Ⅱ廿ＯⅡ０ｆ血ｅ ｍ嘲Ⅱｌ－ｅｄ ｍ日怔咖
式中，ｖ——发酵液样品滴定耗用的ＮａＯＨ量 （ｍＬ）；
ｖｒ—－以空白培养基为对照滴定耗用的ＮａＯＨ量 （ｍＬ）；
３０气、转速为１６０州ｎ恒温摇床培养。于不同的培养
加入无水乙醇３．５ ｍＬｏ
时间，取上述发酵液测其产酸量。
１．３方法 １．３．１醋酸菌分离纯化流程帅
１．３．６大米糖化液中的产酸试验 方法同１．３．３，种子液不变，用取自味莼园酒精度
样品一醋酸菌发酵液中富集培养一稀释分离一纯 ６．３１４％（ｖ，ｖ）大米糖化液代替其液体发酵培养基。
Ｏ．ｏ卜消耗１ ｃＭ广一ＮａＯＨ标准溶液浓度（ｍｏｌ∞； ｍＬ ０．１ｍｏｌ，Ｌ Ｎａ０Ｈ溶液相当于乙 酸的质量（ｇ）； １００盼——转化为百分含量的系数。 １．３．３分离纯化
被捌物质的酸碱性 Ａｃｉｄｉｔｙ跚ｄ正ｋａｌｉｎ奸
极强酸性Ｇ嘲婶８眦ｌＩＥ【ＩｌｅＩｌｅｄ们ｉｄ灯
强中酸强性酸ｓｈ性龃ｓ时吨ｈｃ∞ｎｅｄｉ日ｄ畸ｃｉｄｉ婶
１６０“ｌＩｌｉｎ恒温摇床培养４８ ｈ。以６％的接种量接人盛
１．２．４液体种子及发酵培养基目
有５０ｍＬ液态发酵培养基的２５０ｍＬ三角瓶中（每个
葡萄糖ｌ ｇ，酵母膏１．５ ｇ，磷酸二氢钾０．０５ ｇ，硫酸 镁０．０５ ｇ，水１００ ｍＬ，ｐＨ６．５，灭菌后冷却至６０ ｔ以下
样做３个平行），接种时需充分振荡，以使菌液均匀，
4.期刊论文 周秉辰.ZHOU Bingchen 食醋生产中醋酸菌乙醇脱氢酶的活性与产酸速率关系的研究 -中国酿造
2009,""(11)
菌种分离筛选的5个步骤
菌种分离筛选的5个步骤一、样品采集与处理菌种分离筛选的第一个步骤是样品采集与处理。
在进行菌种分离之前，我们需要选择合适的样品进行采集。
样品可以来自不同的环境，如土壤、水体、动植物等。
采集样品时，我们需要注意卫生和安全，避免污染和交叉感染。
采集后，样品需要进行处理，包括样品的细碎、过滤、稀释等步骤，以便于后续的菌种分离工作。
二、菌种分离菌种分离是菌种分离筛选的核心步骤。
在这一步骤中，我们需要将样品中的微生物菌种分离出来，并培养成单菌种。
常用的分离方法有稀释平板法、涂布平板法、过滤法等。
分离时，需要选择适当的培养基和培养条件，以促进菌种的生长和繁殖。
分离出的单菌种需要进行纯化，以确保其纯度和纯种性。
三、菌种鉴定菌种鉴定是确定分离出的菌种种属和种类的步骤。
鉴定菌种的方法有形态学观察、生理生化特性测定、分子生物学方法等。
通过对菌种的形态、生长特征、代谢产物等进行观察和分析，可以初步确定其分类地位。
而通过分子生物学方法，如16S rRNA基因序列分析，可以更准确地确定菌种的种属和种类。
四、菌种筛选菌种筛选是根据特定需求从众多菌种中选择出具有特殊功能或性质的菌株的步骤。
筛选的目标可以是抗菌活性、产酶能力、产生生物活性物质等。
常用的筛选方法有抗菌活性筛选、产酶能力筛选、生物活性物质筛选等。
在进行筛选时，需要设置合适的筛选条件和指标，并利用适当的方法进行评价和选择。
五、菌种保存与应用菌种保存与应用是菌种分离筛选的最后步骤。
在菌种分离筛选过程中，我们通常会得到很多有潜力的菌株。
为了保证这些菌株的长期保存和应用，我们需要采取相应的保存措施，如冷冻保存、冻干保存、液氮保存等。
同时，我们还可以将这些菌株应用于不同的领域，如农业、医药、环境等。
通过进一步的研究和开发，这些菌株可以发挥出更大的应用价值。
通过以上五个步骤，我们可以从自然环境中分离出具有特殊功能或性质的菌株，并进行进一步的研究和应用。
菌种分离筛选是微生物学研究中的重要工作，对于发现新的生物资源和开发新的生物产业具有重要意义。
产酸微生物分离筛选的一般步骤
产酸微生物分离筛选的一般步骤一、产酸微生物分离筛选的重要性产酸微生物可厉害啦！它们在好多方面都有着重要的作用呢。
比如说在食品发酵工业里，像制作酸奶，就靠那些产酸的微生物来让牛奶变得酸酸甜甜，口感超好。
在环境保护方面，有些产酸微生物能分解一些有害物质，对改善环境有很大的帮助。
要是能把产酸微生物分离筛选出来，就能更好地利用它们的特性啦。
二、样品采集1. 环境选择我们得先想好从哪儿去找这些产酸微生物呢。
像一些酸性的土壤呀，那里面可能就藏着不少产酸微生物。
还有那些发酵的食物，比如说泡菜坛子里面的汁水，那里面肯定也有很多产酸微生物在活动。
果园里的土壤有时候也不错，因为水果腐烂发酵的过程中，也可能有产酸微生物参与呢。
2. 采集方法要是采集土壤样品，就可以用小铲子轻轻地挖取表层土，大概5 - 10厘米深的土就可以啦。
把这些土收集到干净的袋子里，可别让其他杂质混进去哦。
如果是采集泡菜汁之类的液体样品呢，就用干净的滴管或者小勺子把液体取出来，放到干净的小瓶子里。
三、富集培养1. 培养基选择这一步很关键呢。
我们要选择适合产酸微生物生长的培养基。
一般来说，会有一些含有碳源、氮源和其他营养物质的培养基。
比如说葡萄糖作为碳源，蛋白胨作为氮源，再加上一些无机盐啥的。
而且呀，我们可以在培养基里加一些酸碱指示剂，像溴甲酚紫。
如果产酸微生物在里面生长产酸了，培养基的颜色就会发生变化，这样我们就能很容易看出来啦。
2. 培养条件把采集到的样品放到富集培养基里之后，要给它们创造合适的生长条件。
温度很重要哦，不同的产酸微生物适合的温度不一样。
有些喜欢25 - 30摄氏度的环境，就像在春天或者秋天的温度一样舒服。
还有，要注意保持合适的湿度和通气条件。
如果是在摇床里培养的话，要设置好合适的转速，让微生物能充分接触到营养物质。
四、分离纯化1. 平板划线法这是一种很常用的方法。
先把富集培养后的样品在固体培养基上进行平板划线。
用接种环蘸取少量的菌液，在平板上轻轻地划几道线。
醋酸菌的纯化实验报告
一、实验目的1. 掌握醋酸菌的分离和纯化方法。
2. 熟悉实验室无菌操作技术。
3. 了解醋酸菌的生长特性和代谢产物。
二、实验原理醋酸菌（Acetobacter）是一类能使糖类和酒精氧化成醋酸的短杆菌。
在适宜的条件下，醋酸菌可以将乙醇氧化成乙醛，再将乙醛氧化成醋酸。
本实验通过制备适宜的培养基，利用醋酸菌的氧化特性，对醋酸菌进行分离和纯化。
三、实验材料与仪器材料：1. 新鲜果醋2. 葡萄糖碳酸钙培养基3. 1%三氯化铁溶液4. 革兰氏染色液5. 0.1mol/L NaOH标准溶液6. 1%酚酞指示剂7. 无菌水8. 平皿9. 三角瓶10. 吸管11. 试管12. 玻璃珠仪器：1. 高压蒸汽灭菌器2. 灭菌锅3. 灭菌箱4. 恒温培养箱5. 显微镜6. 精密天平四、实验方法与步骤1. 制备培养基：- 称取30g米曲汁，加入500mL三角瓶中。
- 加入0.0002%结晶紫和3%-5%的乙醇。
- 加入3%-5%的碳酸钙。
- 加水定容至1000mL。
- 将培养基煮沸10分钟，过滤除菌。
- 将培养基分装至无菌平皿中，待冷却凝固。
2. 分离和纯化醋酸菌：- 将新鲜果醋进行10倍稀释。
- 取适量稀释液，滴加至平板培养基上，均匀涂布。
- 在平板培养基上滴加1-2滴1%三氯化铁溶液，以促进醋酸菌生长。
- 将平板倒置于恒温培养箱中，培养温度控制在30℃。
- 24小时后，观察菌落生长情况，挑取单菌落进行纯化。
3. 纯化后的菌落观察：- 将纯化后的菌落进行革兰氏染色，观察菌落形态。
- 将纯化后的菌落进行显微镜观察，观察菌体形态。
4. 验证纯化效果：- 将纯化后的菌落接种至葡萄糖碳酸钙培养基中，观察醋酸菌的生长情况。
- 将纯化后的菌落接种至葡萄糖培养基中，观察醋酸菌的代谢产物。
五、实验结果与分析1. 菌落形态：- 观察到纯化后的菌落为圆形、边缘整齐、表面光滑、颜色为白色。
- 革兰氏染色结果显示，纯化后的菌落为革兰氏阳性菌。
2. 显微镜观察：- 观察到纯化后的菌落为短杆状，长度约为1.5-2.5μm，宽度约为0.8-1.2μm。
优良醋酸菌的分离鉴定
优良醋酸菌的分离鉴定徐佳;刘明珠【摘要】采用稀释平板分离法和划线分离法,从自然发酵苹果醋醪液中分离选出优良菌株P-7,并对该菌株的形态学及其生理生化学特征进行研究,该菌株在平板上菌体生长旺盛,菌落呈油脂状,米白色,表面平滑,边缘整齐,培养基内不产生色素,菌落周围产生透明圈,通过革兰氏染色试验和氧化发酵试验,确定该菌种为氧化性的革兰氏阴性杆菌,无鞭毛运动,具有氧化乙醇和乙酸等生化特征,通过《伯杰细菌鉴定手册》,菌株P-7初步鉴定为醋酸醋酸细菌醋酸亚种.【期刊名称】《江西化工》【年(卷),期】2014(000)001【总页数】4页(P90-93)【关键词】醋酸菌;分离;鉴定【作者】徐佳;刘明珠【作者单位】南昌理工学院,江西南昌330045;南昌理工学院,江西南昌330045【正文语种】中文果醋是以水果或果品加工的下脚料为主要原料，经酒精发酵、醋酸发酵酿造而成的一种酸性调味品或饮料[1]。
随着人们生活水平的不断提高，果醋的保健功能也越来越受到人们的重视，正掀起喝果醋的热潮。
在我国民间，食醋生产通常采用存在于自然界中的醋酸菌进行自然发酵。
在工厂为了提高产量和质量，避免杂菌污染，采用人工接种的方式进行发酵。
果醋品种是影响果醋品质的关键因素之一，用于食醋生产的细菌有纹膜醋酸菌(A.aceti)、许氏醋杆菌(A.schutzenbachii)、奥尔兰醋酸酐菌(A.rancens)、巴氏醋酸菌(A.pasteurianus)、巴氏亚种(沪酿1.01)等[2]，但目前使用得最多的是：恶臭醋杆菌、浑浊变种、巴氏醋酸菌、巴氏亚种4种醋酸菌[2]。
目前国内外对醋酸菌优质菌株的分类鉴定及性能等方面已经做了大量的研究工作。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种来源市购残次水果，洗净污垢，打浆，置于实验室，进行自然酒精发酵和醋酸发酵。
待发酵醪液形成刺激性醋味时，开始从中筛选天然的醋酸菌种。
1.1.2 仪器设备电子天平AE-100型(梅特勒—托利多上海公司)；离心机LD5-2A型(北京医用离心机厂)；台式干燥箱(中国重庆)；显微镜(江西凤凰光学仪器有限公司)；生化培养箱LRH-250A型(广东省医疗器械厂)；超净工作台(苏净集团安泰公司制造)；电热恒温水浴锅(上海精密实验设备有限公司)；LS-B501灭菌锅(上海华线医用核子仪器有限公司)；ZHWY-2112B恒温摇床(上海智城分析仪器制造有限公司)等。
发酵猕猴桃果醋用醋酸菌的筛选与鉴定
［摘要］ 目的：从猕猴桃中分离、鉴定及筛选出发酵用醋酸菌，用于猕猴桃果醋的酿造工业，为生产出风味好、质量高 的果醋提供优质菌种来源。方法：以猕猴桃为原料，通过富集培养、分离纯化、产酸定性鉴定、产酸量测定、耐乙醇性能 检验、耐醋酸性能检验，采用基因序列同源性分析法对所分离菌株进行分子生物学鉴定，利用 Mega 7.0 软件构建系统发育 树进行聚类分析。结果：从猕猴桃中共分离鉴定出 3 株产醋酸菌，通过形态学鉴定、革兰染色和产酸量测定，筛选出一株 产酸量为 3.6 g/L 的革兰阴性醋酸菌 L2，最后对其进行耐乙醇和耐醋酸测试，发现此菌株乙醇耐受性为 5%，醋酸耐受性为 1%。3 株菌分子生物学鉴定结果发现按照亲缘关系分属于三个种：苹果醋杆菌 （Acetobacter malorum）：L0；桃醋酸杆菌 （Acetobacter persici）：L2；芝庇侬醋杆菌 （Acetobacter cibinongensis）：L3。结论：本研究分离筛选到的醋酸菌菌株 L2 产 酸量较高，为 3.6 g/L。该菌株经过改良驯化后可作为潜在猕猴桃果醋生产使用的优良醋酸菌发酵菌种。
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醋酸菌菌种分离筛选方法
醋酸菌的细胞为椭圆至杆状，单个成双或成链，鞭毛周生或端生，运动或不运动，革兰氏阴性菌，好氧菌，一般在乙醇或其他可氧化物的酵母煮液或酵母消化液培养基生长旺盛。
醋酸的钠盐和钙盐与三氯化铁共热，生成红褐色沉淀，原液变成无色。
可进行分离菌鉴别。
1.培养基：
1.1米曲汁乙醇碳酸钙培养基：米曲汁（10-12BX）1000mlCaCO
310-15g95℅乙醇30-40ml（灭菌后加入）PH自然
1.2葡萄糖碳酸钙培养基：葡萄糖15g/L酵母膏10g/L CaCO
315g/LPH 6.8
1.3乙醇30mL/L酵母膏10g/L葡萄糖10g/L CaCO
310-15g/L（常规筛选培养基）PH 6.8-7.0注：常规培养基中的碳酸钙易沉淀，平板不易观察到透明圈，选择米曲汁乙醇碳酸钙培养基为好。
1.4醋酸菌保存培养基：酵母膏15g/L葡萄糖10g/L CaCO
315-20g/L琼脂15-20 g/L 3-4滴乙醇/试管。
1.5液体种子和发酵培养基：乙醇30-35mL/L膏酵母10g/葡萄糖10g/L KH
2PO
40.5g/L MgSO
40.5g/L PH 6.5-6.8
2.菌种筛选：
2.1集菌：1-2g（5ml）样品，在无菌下加入30-50ml/250ml米曲汁乙醇液体培养基（0.5ml 0.02℅结晶紫醋酸溶液/100ml培养液）中，
130-33℃震荡培养24-48h，集菌液PH明显下降，有醋味，镜检细胞革兰氏染色阴性。
形态与醋酸菌相符即可分离。
2.2混菌法分离：（分离及初筛）
适度稀释10-5、10-6、10-7取1.0ml菌液置于无菌平板或涂布中，每个梯度平行两次，米曲汁乙醇碳酸钙培养基倒平板，30℃24-48h，观察有小菌落出现，菌落周围形成透明圈，圈的大小因菌而异。
挑透明圈出现早且菌落丰厚，边缘整齐，生长旺盛不同的菌落转接于曲汁乙醇碳酸钙斜面，30-33℃24-48h。
根据菌落周围溶解透明圈大小初步筛选出产酸高的菌种。
2.3性能测定：（复筛）
不同菌落接种于液体曲汁乙醇培养基（30-50ml/250ml）中，30℃震荡培养24-48h。
2.3.1镜检：染色镜检细胞整齐，椭圆或短杆状，革兰氏阴性菌。
2.3.2性能测定：
醋酸定性分析：取发酵液（离心去菌体）5.0ml于洁净试管中，用10℅氢氧化钠中和PH至7.0，加入1℅三氯化铁溶液2-3滴，摇匀，观察溶液是否变黄褐色，加热共沸，形成红褐色沉淀，原液变无色者为产醋酸细菌。
生酸量测定：1.0ml发酵液于150ml三角瓶中，加中性蒸馏水10-20ml，酚酞指示剂2滴，用0.1mol/l氢氧化钠滴定至微红色。
醋酸量（g/100mL）=氢氧化钠摩尔浓度.Vx60.06x10-3/样品毫升数x100
2同时，进行单因素试验，分别考察醋酸速度，耐高温，耐酒精度，耐低酸度等主要生产性能，选择优势菌株。
3。