《酶的分离纯化》PPT课件

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酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择 适当的溶剂。
一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中（水、稀 酸、稀碱、稀盐溶液等） ，非极性物质易溶于非 极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中， 碱性物质易溶于酸性溶剂中
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提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短 扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的 扩散速度，从而增大提取效果。
等等
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酶的提取、分离纯化技术路线
细胞破碎 酶提取
动物、植物或微生物细胞 发酵液
酶分离纯化
酶浓缩 酶贮存
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离心分离，过滤分离，沉淀分 离，层析分离，电泳分离，萃 取分离，结晶分离等。
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酶的分离纯化可以分为三个阶段
1、粗蛋白：多使用盐析沉淀法，可以粗略去除蛋白质以 外的物质；
2、部分纯化：使用各种层析法； 3、均质酶：目标酶的进一步精制纯化，常用电泳或者色
提取液
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3.生物大分子的提取（抽提）
“提取”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎 的细胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充分 地释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态 不丢失生物活性的过程。
酶的定位不同，其提纯难度也不相同
“固相转入液相”，或“从细胞内的生理状况转
入外界特定的溶液中”。 —— 相似相溶
捣碎法 研磨法 匀浆法
温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法
有机溶剂： 甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性剂： Triton、Tween
自溶法 外加酶制剂法
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机械法（注意预冷）：
捣碎法： 10000rpm
研磨法： 匀浆法：研杆和管壁
间只有几百微米
DY89-I型 电动玻璃匀浆机
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为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在 提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取 条件。
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⑴ 盐溶液提取：
一般以低盐溶液(0.05-0.2mol/L)为主。稀盐溶 液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解度大， 是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。
– 盐溶：在低盐浓度条件下，酶的溶解度随盐 浓度增大而增大
第三章 酶的分离纯化与保存
酶的分离纯化是酶学研究的重要环节之一。 针对化学本质是蛋白质的酶而言，其分离纯化
的方法主要沿用蛋白质分离提纯的方法。 酶的分离纯化又有其自身特点：
– 难点：目标酶在细胞中含量少 – 优势：可通过测定酶活性的方法进行示踪 酶的分离纯化是一门实验科学
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酶的分离纯化，就是将 酶从细胞或者其他含酶 的原料中释放出来，再 与杂质分开，而获得符 合研究和使用要求的酶 制品的过程
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细胞结构与酶分布
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胞内酶：在细胞中，酶在核糖体上合成后，即转运到 各个作用部位，并不断补充和更新
胞外酶：合成后穿过质膜，定域到质膜外表面、周质 空间、外膜及细胞外环境中的酶
不同的酶分离纯化的方法不同：胞内产物需经细胞破 碎，细胞碎片分离等步骤；胞外产物则将细胞去除后， 对余下的液体即可进行初步纯化
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材料选定后要尽可能保持新鲜，尽快 加工处理，如暂不提取，应冰冻保存， 且动物材料则需深度冷冻保存：
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动物组织要先除去结缔组织、脂肪等，绞碎 后在适当的溶剂中提取。如果所要求的成分 在细胞内，则要先破碎细胞。
植物要先去壳、除脂。 微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。
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2、 细胞的破碎
将细胞和组织破碎，使酶分子（胞内酶）充分 释放到溶液中，并不丢失生物活性。
不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织， 其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同
– 如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微 生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细 胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。
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选用技术前，需考虑：
1.目标酶分子特性及其他物理、化学性质 2.酶分子和杂质的主要性质差异 3.酶的使用目的和要求 4.技术实施的难易程度 5.分离成本的高低 6.是否造成环境污染
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不同酶的分离、提纯方法，主要根据：
酶分子之间各种选择性的差异 分子大小和形状 酸碱性质 溶解度 吸收性质 对其他分子的生物学亲和力
– 盐析：当盐浓度达到一定界限后，酶的溶解
度随着盐浓度增大而降低
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大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓
度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐
浓度的升高而增加，这称为盐溶现象。
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(2)稀酸（碱）溶液提取
在偏离等电点0.5左右，溶解度增大 根据等电点，选择合适的pH 注意，不能采用极端pH值，操作时要注意避
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细胞破碎方法及其原理
机械破碎
通过机械运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。
物理破碎 化学破碎
通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。
通过各种化学试剂对细胞 膜的作用，而使细胞破碎
酶促破碎
1（酶解破碎） 5
通过细胞本身的酶系或外 加酶制剂的催化作用，使 细胞外层结构受到破坏， 而达到细胞破碎
谱法。
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主要过程： 细胞破碎 酶的提取 离心分离 过滤 沉 淀 层析 电泳 萃 取浓缩干燥 结晶 保存。。。
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一、酶分子制备的前处理
1、生物材料的选择
选择目的酶含量高的 选择容易取材的 利用细胞培养技术和基因工程重组DNA技术。 目前，酶的来源大都为来自微生物
物理法：
反复冻融法：时间长，需加蛋 白酶抑制剂（PMSF、EDTA 等）
超声波处理法：处理时间尽量 短，避免局部过热使得酶失活
渗透压法： 冷热交替法：
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JY92-II D超声波 细胞粉碎机
高压细胞破碎机
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动物
细菌
植物
∣研磨 ∣超声波
∣纤维素酶
∣匀浆 ∣溶菌酶
∣
↓捣碎机 ↓化学溶剂 (甲苯) ↓
免局部过酸或过碱
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(3)变性剂的使用
如：脲、胍等 膜（蛋白）酶，包涵体形式的酶等 有变性剂，蛋白结构松散，易于溶解 去除变性剂，又可恢复原来构象
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典型的抽提液组成
离子强度调节剂：蔗糖、KCl、NaCl等 pH缓冲剂：各种缓冲液 温度效应剂：DMSO、甘油 蛋白酶抑制剂：PMSF、亮肽素 抗氧化剂:DTT,巯基乙醇 重金属络合剂：EDTA 增溶剂：Triton-100