生物技术概论：5.酶工程
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原理：当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，在密度梯度介质中， 颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相等的 位置，在这里颗粒没有重量，不管离心多长时间，它们再也不移动了，形 成一系列密度区。从而使不同浮力密度的物质得到分离。
5.2.2.1 根据酶分子大小和形状的分离方法
酶工程
酶制剂的缺点
酶工程的研究内容
引言
酶工程
酶工程的发展趋势
随着生物技术的发展，酶工程将引起发酵工 业和化学合成工业的巨大变革。21世纪酶工程的 热点和前题，可能包括基因工程和蛋白质工程的 应用，人工合成酶和模拟酶、核酸酶和抗体酶， 分子酶学，酶的定向固定术，杂交酶，分子发动 机，酶化学技术，非水酶学，糖生物学和糖基转 移酶，酶标药物，端粒酶，极端环境微生物和不 可培养微生物的新酶种， 酶在环境保护方面的应 用等。
引言
酶工程
酶
细胞融合 动植物细胞
细 培空
发
养 胞 基气
酵
分 离 纯 化
液
细胞融合 物理化学诱度
发
预
酶
酵
处
制
剂
罐
理
菌
野生菌株采集 基因工程
微 能
生
物量
废体
酶 提
取
分
料
离
酶工程研究内容
固 定
吸附
化
酶
色埋
酶电 极
交联
酶热敏电阻
酶 的
化学连
化
学
逆胶束酶
修
饰
酶 反 应 器
轻工
可
溶
食品工业
性
酶
医药
产 品
产
回
收
5.1 酶的发酵生产
5.1.3 微生物酶的发酵生产
5.1.3.1 培养基
➢ 碳源 ➢ 氮源 ➢ 无机盐类 ➢ 生长因子 ➢ pH值
酶工程
5.1.3微生物酶的发酵生产
5.1.3.2 酶的发酵生产方式
固体发酵法
酶工程
液体深层发酵法 ➢温度
➢通气和搅拌 ➢pH值
固体发酵车间
5.1.3微生物酶的发酵生产
酶工程
5.1 酶的发酵生产
5.1.2基因工程菌（细胞）的构建
构建基因工程菌的目标
酶工程
改善原有酶源自文库各种性能 扩充可安全使用的酶源
5.1.2基因工程菌（细胞）的构建
酶基因克隆及表达的基本步骤
能产生目的酶的生物 酶的纯化 总m RNA的纯化 测定N端部分氨基酸序列 mRNA
酶工程
设计引物
RT-PCR
5.1.3.3 提高酶产量的措施 添加诱导物
➢酶的作用底物 ➢酶的反应产物 ➢酶的底物类似物
酶工程
5.1.3.3提高酶产量的措施
酶工程
降低阻遏物浓度 可采用难利用的碳源，或采用分次添加碳源的方法使培养
基中的碳源保持在不至于引起分解代谢物阻遏的浓度。 表面活性剂
非离子型表面活性剂常被作为产酶促进剂， 但作用机制尚不清楚。 添加产酶促进剂
➢ 温度
➢ pH值
➢ 盐浓度
➢ 搅拌
➢ 微生物污染
HPLC
5.2 酶的分离纯化
5.2.1 酶制剂的制备
➢破碎细胞 ➢溶剂抽提 ➢离心分离
大多数酶蛋白都可用稀酸、 稀碱或稀盐溶液抽提，抽提 时应注意溶剂种类、溶剂量 和溶剂pH等的选择。
高压均质细胞破碎机
➢浓缩 ➢干燥
工业上常采用真空 薄膜浓缩法以保证 酶在浓缩过程中基 本不失活。
酶溶液或者含水量高的酶制剂即使在 低温下也极其不稳定，只能作短期保 存。常用的干燥方法有真空干燥、冷 冻干燥和喷雾干燥。
超声波细胞破碎机 高速冷冻离心机
5.2 酶的分离纯化
酶工程
5.2.2 酶的纯化与精制 5.2.2.1根据酶分子大小和形状的分离方法
离心分离
根据颗粒大小和密度的不同存 在的沉降速度差别，分级增加 离心力，从试样中依次分离出 不同组分的方法。
产酶促进剂是指那些能提高酶产量但是作用机制尚未阐 明的物质，它可能是酶的激活剂或者稳定剂，也可能是产酶微 生物的生长因子，或者是有害金属的螯合剂。如，添加植酸钙 可使多种霉菌的蛋白酶和橘青酶（P.citrinum）的5’-磷酸二酸 酯酶的产量提高2~20倍。
5 酶工程
酶工程
5.2酶的分离纯化 提取和分离纯化酶时一般应注意的条件
5 酶工程
酶工程
5 酶工程
学习目的
初步掌握酶的发酵生产和分离纯化的 大致流程以及酶制剂的保存法。对酶的固 定化、酶的修饰改造和主要的酶反应器类 型有一定的认识。了解生物传感器及酶对 现代人类生活的影响。
引言
酶工程
酶与酶工程 酶的催化特性
酶是一种生物催化剂，它具有作用专一性强、 催化效率高等特点，能在常温常压和低浓度 条件下进行复杂的生化条件。
可以通过诱导、诱变及基因工程等方法培育出新的 产酶量高的菌种。
5.1 酶的发酵生产
5.1.1优良产酶菌种的筛选
优良的产酶菌种应具备的优点 繁殖快、产酶量高
能在便宜的底物上生长良好
产酶性能稳定、菌株不易退化
产生的酶容易分离纯化
酶工程
5.1.1优良产酶菌种的筛选
产酶菌种的筛选方法
筛选步骤 产酶菌株的检测 胞外酶的产酶菌株的检测 胞内酶的产酶菌株的检测
与合适的载体重组、重组子筛选与鉴定
转入工业生产用的宿主（工程菌或工程细胞），如米曲霉
酶的工业化生产
5.1.2基因工程菌（细胞）的构建
酶工程
克隆酶基因的宿主-载体系统应具备的特性
✓所希望的酶占细胞总蛋白量的比例要高; ✓菌体容易大规模培养，生长无特殊要求； ✓载体与宿主相容，且能在宿主中稳定维持； ✓宿主的蛋白酶尽可能少； ✓宿主菌对人安全，不分泌毒素。
凝胶过滤
原理分离酶蛋白时，分子大小大于凝胶孔径的蛋白质被凝胶排阻，因而在凝胶颗
粒间隙中移动，速度较快；小分子蛋白质则可自由出入凝胶颗粒的小孔内，路径加 长，移动缓慢。这样经过一定的长度的凝胶层析柱以后，不同大小的蛋白质就被分 开了。
5.2.2.1 根据酶分子大小和形状的分离方法
酶工程
➢ 介质的特性
工
品
艺
废
分析
生物工程
料
5 酶工程
5.1酶的发酵生产
酶的来源 从动植物组织中分离提取
植物细胞培养产酶
动物细胞培养产酶
微生物发酵产酶
酶工程
5.1 酶的发酵生产
酶工程
微生物作为酶生产来源的优点
生长繁殖快，生活周期短，产量高，酶比活很高；
培养方法简单，原料来源丰富，经济效益高；
微生物菌株种类繁多，酶的品种齐全；
➢差速离心 ➢速率区带离心
➢等密度梯度离心
超速冷冻离心机
速率区带离心:
将样品置于一密度梯度介质(如蔗糖、甘油、聚蔗糖等)顶层，该梯度最大密 度低于拟分离混合物的最小密度，离心时各物质(细胞、细胞器、分子等)按 其大小、形状和密度的不同而沉降速率各异，分别沉降在不同区带而达到分 离的方法。
等密度梯度离心
5.2.2.1 根据酶分子大小和形状的分离方法
酶工程
酶制剂的缺点
酶工程的研究内容
引言
酶工程
酶工程的发展趋势
随着生物技术的发展，酶工程将引起发酵工 业和化学合成工业的巨大变革。21世纪酶工程的 热点和前题，可能包括基因工程和蛋白质工程的 应用，人工合成酶和模拟酶、核酸酶和抗体酶， 分子酶学，酶的定向固定术，杂交酶，分子发动 机，酶化学技术，非水酶学，糖生物学和糖基转 移酶，酶标药物，端粒酶，极端环境微生物和不 可培养微生物的新酶种， 酶在环境保护方面的应 用等。
引言
酶工程
酶
细胞融合 动植物细胞
细 培空
发
养 胞 基气
酵
分 离 纯 化
液
细胞融合 物理化学诱度
发
预
酶
酵
处
制
剂
罐
理
菌
野生菌株采集 基因工程
微 能
生
物量
废体
酶 提
取
分
料
离
酶工程研究内容
固 定
吸附
化
酶
色埋
酶电 极
交联
酶热敏电阻
酶 的
化学连
化
学
逆胶束酶
修
饰
酶 反 应 器
轻工
可
溶
食品工业
性
酶
医药
产 品
产
回
收
5.1 酶的发酵生产
5.1.3 微生物酶的发酵生产
5.1.3.1 培养基
➢ 碳源 ➢ 氮源 ➢ 无机盐类 ➢ 生长因子 ➢ pH值
酶工程
5.1.3微生物酶的发酵生产
5.1.3.2 酶的发酵生产方式
固体发酵法
酶工程
液体深层发酵法 ➢温度
➢通气和搅拌 ➢pH值
固体发酵车间
5.1.3微生物酶的发酵生产
酶工程
5.1 酶的发酵生产
5.1.2基因工程菌（细胞）的构建
构建基因工程菌的目标
酶工程
改善原有酶源自文库各种性能 扩充可安全使用的酶源
5.1.2基因工程菌（细胞）的构建
酶基因克隆及表达的基本步骤
能产生目的酶的生物 酶的纯化 总m RNA的纯化 测定N端部分氨基酸序列 mRNA
酶工程
设计引物
RT-PCR
5.1.3.3 提高酶产量的措施 添加诱导物
➢酶的作用底物 ➢酶的反应产物 ➢酶的底物类似物
酶工程
5.1.3.3提高酶产量的措施
酶工程
降低阻遏物浓度 可采用难利用的碳源，或采用分次添加碳源的方法使培养
基中的碳源保持在不至于引起分解代谢物阻遏的浓度。 表面活性剂
非离子型表面活性剂常被作为产酶促进剂， 但作用机制尚不清楚。 添加产酶促进剂
➢ 温度
➢ pH值
➢ 盐浓度
➢ 搅拌
➢ 微生物污染
HPLC
5.2 酶的分离纯化
5.2.1 酶制剂的制备
➢破碎细胞 ➢溶剂抽提 ➢离心分离
大多数酶蛋白都可用稀酸、 稀碱或稀盐溶液抽提，抽提 时应注意溶剂种类、溶剂量 和溶剂pH等的选择。
高压均质细胞破碎机
➢浓缩 ➢干燥
工业上常采用真空 薄膜浓缩法以保证 酶在浓缩过程中基 本不失活。
酶溶液或者含水量高的酶制剂即使在 低温下也极其不稳定，只能作短期保 存。常用的干燥方法有真空干燥、冷 冻干燥和喷雾干燥。
超声波细胞破碎机 高速冷冻离心机
5.2 酶的分离纯化
酶工程
5.2.2 酶的纯化与精制 5.2.2.1根据酶分子大小和形状的分离方法
离心分离
根据颗粒大小和密度的不同存 在的沉降速度差别，分级增加 离心力，从试样中依次分离出 不同组分的方法。
产酶促进剂是指那些能提高酶产量但是作用机制尚未阐 明的物质，它可能是酶的激活剂或者稳定剂，也可能是产酶微 生物的生长因子，或者是有害金属的螯合剂。如，添加植酸钙 可使多种霉菌的蛋白酶和橘青酶（P.citrinum）的5’-磷酸二酸 酯酶的产量提高2~20倍。
5 酶工程
酶工程
5.2酶的分离纯化 提取和分离纯化酶时一般应注意的条件
5 酶工程
酶工程
5 酶工程
学习目的
初步掌握酶的发酵生产和分离纯化的 大致流程以及酶制剂的保存法。对酶的固 定化、酶的修饰改造和主要的酶反应器类 型有一定的认识。了解生物传感器及酶对 现代人类生活的影响。
引言
酶工程
酶与酶工程 酶的催化特性
酶是一种生物催化剂，它具有作用专一性强、 催化效率高等特点，能在常温常压和低浓度 条件下进行复杂的生化条件。
可以通过诱导、诱变及基因工程等方法培育出新的 产酶量高的菌种。
5.1 酶的发酵生产
5.1.1优良产酶菌种的筛选
优良的产酶菌种应具备的优点 繁殖快、产酶量高
能在便宜的底物上生长良好
产酶性能稳定、菌株不易退化
产生的酶容易分离纯化
酶工程
5.1.1优良产酶菌种的筛选
产酶菌种的筛选方法
筛选步骤 产酶菌株的检测 胞外酶的产酶菌株的检测 胞内酶的产酶菌株的检测
与合适的载体重组、重组子筛选与鉴定
转入工业生产用的宿主（工程菌或工程细胞），如米曲霉
酶的工业化生产
5.1.2基因工程菌（细胞）的构建
酶工程
克隆酶基因的宿主-载体系统应具备的特性
✓所希望的酶占细胞总蛋白量的比例要高; ✓菌体容易大规模培养，生长无特殊要求； ✓载体与宿主相容，且能在宿主中稳定维持； ✓宿主的蛋白酶尽可能少； ✓宿主菌对人安全，不分泌毒素。
凝胶过滤
原理分离酶蛋白时，分子大小大于凝胶孔径的蛋白质被凝胶排阻，因而在凝胶颗
粒间隙中移动，速度较快；小分子蛋白质则可自由出入凝胶颗粒的小孔内，路径加 长，移动缓慢。这样经过一定的长度的凝胶层析柱以后，不同大小的蛋白质就被分 开了。
5.2.2.1 根据酶分子大小和形状的分离方法
酶工程
➢ 介质的特性
工
品
艺
废
分析
生物工程
料
5 酶工程
5.1酶的发酵生产
酶的来源 从动植物组织中分离提取
植物细胞培养产酶
动物细胞培养产酶
微生物发酵产酶
酶工程
5.1 酶的发酵生产
酶工程
微生物作为酶生产来源的优点
生长繁殖快，生活周期短，产量高，酶比活很高；
培养方法简单，原料来源丰富，经济效益高；
微生物菌株种类繁多，酶的品种齐全；
➢差速离心 ➢速率区带离心
➢等密度梯度离心
超速冷冻离心机
速率区带离心:
将样品置于一密度梯度介质(如蔗糖、甘油、聚蔗糖等)顶层，该梯度最大密 度低于拟分离混合物的最小密度，离心时各物质(细胞、细胞器、分子等)按 其大小、形状和密度的不同而沉降速率各异，分别沉降在不同区带而达到分 离的方法。
等密度梯度离心