可溶性蛋白质含量的测定

可溶性蛋白质含量的测定
考马斯亮蓝G—250染色法
一．原理
考马斯亮蓝G—250染色法是利用蛋白质与染料结合的原理，定量地测量蛋白质浓度的快速灵敏的方法。

考马斯亮蓝G—250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。

它和蛋白质通过范德瓦尔键结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。

此染料与蛋白质结合后颜色由红色转变成蓝色，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h之后，蛋白质—染料复合物发生聚合并沉淀出来。

此法灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍）易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。

其缺点是在蛋白质很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。

二．实验材料、试剂与仪器设备
1．实验材料
水稻不同萌发时期的种子
2.试剂
（1）标准蛋白质溶液（100μg/mL牛血清白蛋白）。

称取牛血清白蛋白25mg，加水溶解并定容至100mL,吸取上述溶液40Ml,用蒸馏水稀释至100mL即可。

（2）考马斯亮蓝试剂。

称取100mg考马斯亮蓝G—250，溶于50mL90%乙醇中，加入100mL85%的磷酸，再用蒸馏水定容到1000mL，贮于棕色瓶中。

常温下可保存一个月。

3.仪器和设备
分光光度计，离心机，研钵，烧杯，量瓶，移液管，试管等。

三．实验步骤
1.标准曲线的绘制
取6支试管，按下表加入试剂，摇匀，向各管中加入5mL考马斯亮蓝试剂，摇匀，并放置5min左右，以0号试管为空白对照，在595nm下比色测定吸光度。

以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

2.样品测定
（1）样品提取。

称取鲜样0.25—0.5g，用5mL蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，3000r/min 离心10min，上清液备用。

（2）吸取样品提取液1.0mL（视蛋白质含量适当稀释），放入试管中（每个样品重复2次），加入5mL考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2min后在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查的蛋白质的含量。

四．结果计算
样品蛋白质的含量=C V／1000VW(mg／g)
式中：C—查标准曲线值，ug；
VT—提取液总体积，mL；
WF—样品鲜重，g；
VS—测定时加样量，mL。