实验一 特殊显微镜的工作原理和使用

-明相差
+暗相差
相差显微镜，能够通过 其复杂的结构，改变直 射光或衍射光的相位， 并且利用光的衍射和干 涉现象，把相差变成振 幅差，即明暗差，可以 被我们的感觉器官所感 知。 同时它还吸收部分直射 光线，以增大其明暗的 反差。因此可用以观察 活细胞或未染色标本。

相差显微镜的构造特点

相差显微镜的构造以普通显微镜为基础，与普通显 微镜的主要不同之处是：用环状光阑代替可变光阑， 用带相板的物镜(通常标有PH的标记)代替普通物镜， 并带有一个调节合轴用的望远镜。
用途
特点: 鉴定活体细胞最实用、最经济的方法
缺点:
需要光强高 切片不能太厚(5~10um) 盖片、载片需符合标准 最好配用单色滤光镜 荧光效果不如明场物镜
三、荧光显微镜
荧光概念


荧光：物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态， 再回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光——冷光。 可分为：化学荧光（氧化还原反应发出的荧光）、光化荧光（光 源激发而产生的荧光）、生物荧光、放射荧光。荧光显微镜应用 的是光化荧光。 荧光现象：荧光物质吸收长波光（320-400nm）的能量，以较长 波长的可见光形式发射出去，这种现象就是荧光现象。



滤色系统

荧光光源的采用超高压汞灯，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有 一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、 蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其 他光都吸收掉。 每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。 荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面 需加阻断(或压制)滤光片。它的作用有二： 一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免于扰荧光和损伤眼睛? 二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须 选择配合使用。
要求与注意事项

(1)制作标本时所用的载玻片和盖玻片均应清洁干净，必须使用薄玻 片(载玻片厚度约1.O～1.1mm，盖玻片厚度约0.1mm)，否则会影响 暗视野集光器斜射光焦点的调节，如载玻片太厚，焦点只能落在载玻 片内，就不能看到物像。标本也不能过厚。 (2)采用的光源宜强，一般均用强光灯照明。光线暗则物像不清晰。 (3)调节光源：使光线集中在暗视野集光器上。先用低倍镜观察，移 动暗视野集光器，使其中央的一个圆圈恰好处在视野的中央。如暗视 野集光器已准确固定好，则可免去这一步骤。 (4)先在暗视野的集光器上加香柏油一滴，然后将标本放在载物台上， 把暗视野集光器向上移，使其上的柏木油与标本片的底面接触，中间 不能有气泡存在。 (5)高倍观察：在标本盖玻片上再加香柏油一滴，降下镜筒，使油镜 浸在香柏油内，再用粗、细螺旋调节物镜的焦距，有时还需稍微升降 暗视野集光器以调节斜射光焦点，使其正好落在标本上，并且调节油 镜头的光圈，相互配合，直到物像清楚为止，即可开始检查。 也可用低倍或高倍物镜进行镜检，这就不必在盖玻片上加香柏油。
使用方法 （1）相差装置的调换安装 卸下普通显微镜使用的聚光器，将环状光阑装 在聚光器支架上，把绿色滤光片放在上面，它可吸 收红色和蓝色光，使波长范围小的单色光线进行照 明，并有吸热作用，能使相差观察获得良好的效果。 再从转换器上旋下普通物镜，换上相差物镜。 （2）调焦 打开光源，旋转集光器转盘，将“0”对准标示孔， 使普通聚光器部分进入光路。先使用低倍相差物镜， 按普通显微镜操作方法进行对光和调焦。 旋转环状 光阑，使光阑的直径和孔宽与所使用的相差物镜相 适应，如相差物镜为40X时应用40X标示孔的光阑。




调轴望远镜：是用来进行合铀调节的。使用不同的相差物镜时，应配 合相应的环状光圈，并用合轴调节望远镜观察环状光圈和相板，调节 至环状光圈的亮环与相板的暗环完全重合。这样，光线通过标本后， 就必须经过相板而发生相位的改变，造成明暗差异的影像。 要使得聚光镜下面环状光阑的中心与物镜光轴要完全在一直线上，必 需调节光阑的亮环和相板的环状圈重合对齐，才能发挥相差显微镜的 效能。 否则直射光或衍射光的光路紊乱，应被吸收的光不能吸收，该推迟相 位的光波不能推迟，就失去了相差显微镜的作用。 环状光圈、相差物镜配合与调节好之后，其他操作方法与普通光学显 微镜相同。

(二) 制作中央遮光板

普通显微镜只要聚光器是可以拆卸的，支架的口径适于安装暗视野 聚光器，即可改装成暗视野显微镜。 在无暗视野聚光器时，可用厚黑纸片制作一个中央遮光板，放在普 通显微镜的聚光器下方的滤光片框上，也能得到暗视野效果。
(1)．将显微镜聚光器调到最高位置，用低 倍镜对好焦距。 (2)．取下目镜，从镜筒中观察并调节光阑 的大小，使其与镜筒中所见物镜的视野相等。 (3)．用厚黑纸剪制中央挡光板。外圈直径 与滤光片框架相同，中央部分的大小与调节 好的光阑孔径一样(可用半透明的小纸片， 放在通光孔处聚光镜镜面上，纸上显示的光 斑即为光阑的孔径，再用圆规量取大小)。 (4)．将中央挡光板放在滤光片框架上，开 大光阑进行样品观察。 如需使用高倍镜作暗视野观察，应按高倍镜对焦后的视野大小 重新制作中央挡光板。
实验一
特殊显微镜的工作原理和使用
放大倍数和数值孔径 10/0.25 ， 40/0.65 ，100/1.3
标准机械筒长和盖玻片厚度 160/0.17 160/0或160/ 160/∞/0或∞/油浸物镜：oil、oel、Hi等 水浸物镜：W或Water 甘油浸物镜：Glyz和Glye 复消色差物镜：APO 半复消色差物镜：FL 平场物镜：PL

荧光的性质： 1、 吸收光，必需有激发光源 2、荧光波长＞激发波长（损失热能） 3、荧光强度小于激发光的强度 4、有不同程度的衰减 5、 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、 荧光效率
荧光的产生
一次荧光：又叫自发荧光或固有荧光，经过紫外光照射 直接发出荧光。 二次荧光：又叫继发荧光，被观察物体经过荧光染料处 理之后，经过紫外光照射才能发出荧光。 荧光染料种类很多：
相差环则是由大小不同的环状孔形 成的光阑，放置在光源通路上，使 光线只能由环状部分通过，环状光 圈的大小可由集光镜的数值口径 (N.A)来调节。
环状光圈的大小由不同大小的环状 孔控制。环状光阑的直径和孔宽是 与不同的物镜相匹配的。其作用是 将直射光所形成的像从一些衍射旁 像中分出来。
相差环
相差物镜是在物镜的后焦点处加一环状相板。 相板由光学玻璃制成，安装在物镜的后焦面处，相板装有 吸收光线的吸收膜和推迟相位的相位膜，具有改变相位的 作用。 它除能推迟直射光线或衍射光的相位以外，还有吸收光使 亮度发生变化的作用。放大倍数不同的物镜，其相板也不 同。

荧光显微镜原理

荧光显微镜利用一个高发光效率的点光源，经 过滤色系统发出一定波长的光(如波长短的紫外 光365nm或紫蓝光420nm)作为激发光、激发标 本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后， 再通过物镜和目镜的放大进行观察。

这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也 易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能 以及化学成分等的研究。
特殊显微镜是与明视场普通显微镜相对而
言，在成像原理、结构和用途上存在差异 的显微镜。
这里介绍：
1、暗视场显微镜 2、相差显微镜 3、荧光显微镜
一、 暗视场显微镜
应用：微小粒子、细菌 形态、细菌记数，透 明标本观察等。
(一) 原理和结构特点


在日常生活中，室内飞扬的微粒灰 尘是不易被看见的，但在暗的房间 中若有一束光线从门缝斜射进来， 灰尘便粒粒可见了，这是光学上的 丁达尔现象。 暗视场显微镜就是利用此原理设计 的。
丁达尔现象

暗视场显微镜是在普通光学显微镜中去除明视场聚光器， 换上一个暗视场聚光器而成。 它的结构特点主要是使用中央遮光板或暗视场聚光器， 常用的是抛物面聚光器，使光源的中央光束被阻挡,不 能由下而上地通过标本进入物镜。从而使光线改变途径， 倾斜地照射在观察的标本上。
暗场照明光路图
明场普通显微镜成像光路图


人口腔上皮细胞在不同显微镜下的图像
普通显微镜
暗视场显微镜
相差显微镜
（二）相差显微镜
原理和结构特点

光波有振幅（亮度）、波长（颜色）及相位(指在某一时间上光的波动所能达 到的位置)的不同。当光波遇到物体时，其波长(颜色)和振幅(亮度)发生变化， 于是就能看到物体， 当光波通过透明的物体时，虽然物体的内部不同结构会有厚度和折光率不同 的差异，而波长和振幅则仍然是不会发生改变的。因此，就不易看清这些不 同的结构。 用普通光学显微镜观察一些活的微生物或其他细胞等透明物体时，也就不易 分清其内部的细微结构。
（3）合铀调整 拔出目镜，插入合铀望远镜，一边从望远 镜向内观察，并用左手固定其外筒；一边用右 手转动望远镜内筒使其上升，当对准焦点就能 看到环状光阑的亮环和相板的暗环，此时可将 望远镜固定住。再升降集光器并调节其下的螺 旋使亮环的大小与暗环一致，然后左右前后调 节环状光阑聚光器上的调节钮，使两环完全重 合。 （4）观察 换回目镜，按常规要领进行观察。在更换 不同倍率的相差物镜时，每一次都要使用相匹 配的环状光阑。
成像特点及优缺点

在暗视野中所观察到的是被检物体的衍射光图像,并非物 体的本身，所以只能看到物体的存在和运动，不能辨清物 体的细微结构，只能呈现出物体的轮廓而且比实物要大。

但被检物体为非均质时，并大于1／2波长，则各级衍射光 线同时进入物镜，在某种程度上可观察物体的构造。
一般暗视野显微镜虽看不清物体的细微结构，但却可分辨 0.004um以上的微粒的存在和运动，这是普通显微镜(最 大的分辨力为0.2um)所不具有的特性，可用以观察活细 胞的结构和细胞内微粒的运动等。
荧光显微镜结构特点

荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加 上一些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束 分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。
光源

现在多采用200W的超高压汞灯作光源，它是用石英玻璃制作，中间呈球形， 内充一定数量的汞，工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅 速升高，当水银完全蒸发时，可达50～70个标准大气压力，这一过程一般约 需5～15min。超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过 程中发射光量子的结果。它发射很强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物 质，因此，为荧光显微镜普遍采用。 超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必须有良好的散热条件，工作环境 温度不宜太高。 200W超高压汞灯的平均寿命，在每次使用2h的情况下约为200h，开动一次 工作时间愈短，则寿命愈短，如开一次只工作20min，则寿命降低50%。因 此，使用时尽量减少启动次数。灯泡在使用过程中，其光效是逐渐降低的。 灯熄灭后要等待冷却才能重新启动。点燃灯泡后不可立即关闭，以免水银蒸 发不完全而损坏电极，一般需要等15min。 超高压汞灯（100W或200W）光源的电路和包括变压、镇流、启动几个部分。 在灯室上有调节 灯泡发光中心的系统，灯泡球部后面安装有镀铝的凹面反 射镜，前面安装有集光透镜。
用途

相差显微镜是利用样品中质点折射率的不同或质 点厚度的不等，产生光线的相位差，使新鲜标本 不必染色就可以看到，而且能够观察到活细胞内 线粒体及染色体等精细结构，还可以应用于霉菌、 细菌、病毒等更微小活体的研究，进行标本形态、 数量、活动及分裂、繁殖等生物学行为观察，并 可进行量度与比较。
用途：观察未经染色的玻片标本

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但是，光线通过厚度不同的透明物体时，其相位却会发生改变，形成 相差。不过，相差不表现为明暗和颜色的差异，这种微小的变化，人 眼是无法加以鉴别的，故在普通显微镜下难以观察到。 我们可以利用光学的相干干涉原理，可以把相差改变为振幅差，这样 就能使透明的、厚度和性质不均匀的结构表现明暗的不同，能够较清 楚地予以区别。 如果这两条光波射到光屏的同一点上，而且一条光波比另一条光波迟 滞了半个波长，即两条光波因位相相反而互相干涉抵消则光线消失， 或者相对振幅相互影响而光线减弱。如果一条光波虽然迟滞了一个波 长,但两条光波位相相同,则因波的叠加而光线增强