参苓白术散对腹泻小鼠胃肠运动功能的影响及机制探讨_万国靖

的策略。

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（收稿日期：2012-06-20）

参苓白术散对腹泻小鼠胃肠运动

功能的影响及机制探讨

万国靖，张守堂，车丽萍

（武警黑龙江省总队医院，哈尔滨150076）

摘要：目的通过对腹泻小鼠胃肠运动和腹泻大鼠结肠中胃肠肽蛋白表达影响的研究，探讨参苓白术散对腹泻的作用及其机制。方法采用番泻叶泻下法复制模型，观察小鼠的排便次数、腹泻率、稀便级、稀便率、腹泻指数；用碳末推进法观测小肠碳末推进率的变化；免疫组织化学法检测结肠中P物质（SP）、血管活性肠肽（VIP）蛋白表达，观察参苓白术散对其干预作用。结果经番泻叶泻下法复制模型后，小鼠的排便次数、腹泻率、稀便级、稀便率、腹泻指数升高；大鼠结肠中SP和VIP蛋白表达升高。参苓白术散治疗后，腹泻小鼠排便次数、腹泻率、稀便级、稀便率、腹泻指数降低，小肠推进被抑制；大鼠结肠中SP、VIP蛋白表达降低。结论参苓白术散可以明显抑制胃肠运动，降低SP、VIP蛋白表达可能是其作用机制之一。

关键词：参苓白术散；腹泻；P物质；血管活性肠肽

中图分类号：R442．2文献标志码：A文章编号：1002-266X（2012）48-0048-03

近年来腹泻发病率上升，严重影响人的身体健康。现代研究表明，胃肠运动功能紊乱是引起腹泻的主要原因，其中P物质（SP）、血管活性肠肽（VIP）与胃肠运动功能紊乱密切相关。SP和VIP是重要的非循环肠肽激素，特别是对胃肠道运动、分泌和吸收起重要作用。参苓白术散临证常用治疗腹泻，如胃肠运动功能紊乱之证。我们于2011年3 8月进行本实验，以参苓白术散对SP、VIP的作用作为切入点，探讨该方对胃肠运动功能紊乱的作用，以明确参苓白术散的作用机制。

1材料与方法

1．1实验动物清洁级昆明种小鼠，体质量18 22g，雌雄各半，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，合格证号：P0*******。清洁级Wistar大鼠，体质量220 250g，雌雄各半，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，合格证号：P0*******。室温（18ʃ2）ħ，相对湿度45% 50%，空气新鲜，通风良好，自由摄食、饮水。

1．2实验药物中药均购于黑龙江中医药大学第一附属医院中药局。参苓白术散：人参、白术、白茯苓、山药、薏苡仁、白扁豆、缩砂仁、桔梗、甘草。按国家炮制标准进行炮制后，提取加工成水剂（浓度为1．7）；番泻叶制剂：以90ħ热水将番泻叶浸出（浓度为0．1）；思密达：由博福益普生制药有限公司生产（批号：2010．1）按3g/50mL配制成浓度为6%的溶液待用。

1．3试剂与仪器SP试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，批号：2010．1）；VIP试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，批号：2010．2）；PV-6001二步法免疫组化试剂盒（北京中山生物技术有限公司，批号：

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2010．2）；DAB（北京中山生物技术有限公司，批号：2010．2）；阿拉伯树胶（天津市东丽区丽昌化工有限公司，批号：0700411）；无水乙醇（天津市富宇精细化学品有限公司，批号：0900321）；二甲苯（泰州凯盛化工公司，批号：20090721）；多聚甲醛（青岛天奇化工有限公司，批号：20100211）；活性炭；电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司，DHG-9140A）；研究用生物显微镜（日本OLYMPUS公司，BX60）及轮转式组织切片机（德国徕佧公司，2135）；Motic Med6．0CMIAS 系列数码医学图像分析系统（中国）。

1．4对小鼠胃肠运动影响的研究

1．4．1造模方法选用40只昆明种小鼠，所有小鼠在造模前禁食12h，自由饮水。随机抽取10只编入正常对照组，其余小鼠用于复制腹泻模型。第1、2天正常对照组用生理盐水灌胃（15mL/kg），同时其余小鼠均灌服番泻叶（15mL/kg），观察各组造模是否成功。

1．4．2分组及给药将30只造模小鼠随机分为3组：参苓白术散组、思密达组、腹泻模型组。将4组小鼠单只分笼，自由饮水，限制其饮食，在鼠笼的笼底垫有滤纸以便收集数据。第3天起正常对照组灌服生理盐水（15mL/kg），参苓白术散治疗组和思密达治疗组分别给予参苓白术散和思密达治疗（均15 mL/kg），腹泻模型组灌服生理盐水（15mL/kg），连续3d，观察小鼠灌胃后4h内的大便情况（包括稀便数、总便数、稀便级），并计算腹泻指数。

1．4．3观察指标腹泻率：排便的动物数与该组动物总数的百分比。稀便率：每只动物所排的稀便数与总便数之比。稀便级：表示稀便的程度。以稀便污染滤纸形成污迹而积的大小定级。分为4级：1级：污迹直径＜1cm；2级：污迹直径1 1．9cm；3级：污迹直径2 3cm；4级：污迹直径＞3cm。统计时先逐个统计每1堆稀便的级数，然后将该鼠所有稀便级数相加除以稀便次数得稀便的平均级数，简称稀便级。腹泻指数：稀便率与稀便级的乘积。1．5对小鼠小肠碳末推进运动影响的实验研究1．5．1小肠碳末推进率的测定取昆明种小鼠40只，随机分为正常对照组、参苓白术散组、思密达组、腹泻模型组。将各组小鼠禁食不禁水18h后，正常对照组灌服生理盐水（15mL/kg），参苓白术散治疗组和思密达治疗组分别给予参苓白术散和思密达治疗（15mL/kg），腹泻模型组灌服生理盐水（15mL/ kg）。15min后各组分别5%活性炭混悬液（先把10%阿拉伯树胶加热至澄清后加入5%碳末，搅均）灌胃（20mL/kg）。30min后处死小鼠，打开腹腔剪取上端至幽门、下端至回盲部的肠管，置于玻璃板上。1．5．2观察指标观察炭末推进距离，测自幽门括约肌至小肠炭末移动最前端的距离和幽门括约肌至盲肠根部的总距离，二者百分比为炭末推进率。推进率=炭末推进距离（cm）/小肠全长（cm）ˑ100%。

1．6对大鼠结肠SP、VIP含量影响的实验研究1．6．1造模方法选取40只Wistar大鼠，所有大鼠在造模前禁食12h，自由饮水。随机抽取10只编入正常对照组，其余用于复制腹泻模型。第1、2周正常对照组用生理盐水灌胃（10．6mL/kg），其余大鼠均用番泻叶灌胃（10．6mL/kg），观察各组造模是否成功。1．6．2分组及给药将30只造模大鼠随机分为：参苓白术散组、腹泻模型组、思密达组3组，每组10只。第3周后，参苓白术散组和思密达组按10．6 mL/kg剂量灌胃给药，正常对照组、腹泻模型组按等体积生理盐水灌胃，每组均给药2周。

1．6．3组织取材及处理脱颈处死大鼠，沿腹正中线剪开皮肤，暴露腹腔，分离结肠，切取盲肠上结肠2cm，投入4%多聚甲醛固定液中。固定2h后取出，切成2cmˑ1cmˑ0．2cm大小的组织块，继续固定2h。在室温下以乙醇进行梯度脱水（80%乙醇1次、95%乙醇2次、100%乙醇3次），再以二甲苯透明。用54ħ低熔点石蜡浸蜡2次，包埋。5μm常规切片。裱于防脱片剂处理过的干净载玻片上，置60ħ恒温箱中烤片4h备用。采用免疫组织化学方法检测结肠中SP、VIP蛋白表达。

1．6．4观察指标免疫组织化学方法检测结肠中SP、VIP蛋白表达。观察标准：细胞核被染成棕褐色为阳性（+），细胞核被染成紫蓝色为阴性（－）。在30个高倍视野下应用数码医学图像分析系统测定SP、VIP阳性目标面密度（IOD），取均值。

1．7统计学方法数据处理应用SPSS10．0统计软件。实验数据以珋xʃs表示，组间比较采用t检验。以P≤0．05为差异有统计学意义。

2结果

2．1参苓白术散对腹泻小鼠胃肠运动的影响见表1。

2．2参苓白术散对小鼠小肠推进运动的影响见表2。

2．3参苓白术散对大鼠结肠中SP、VIP蛋白表达的影响见表3。

2．4光镜结果各组大鼠结肠组织细胞中均可见SP、VIP免疫染色阳性细胞，以肠腺隐窝部位较多。见插页Ⅳ图19、20。

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