基因传递
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(1) 脂质体/DNA超分子组装体 (2) 聚合物/ DNA超分子组装体 (3) 脂质体/多聚物/DNA超分子组装体
基因超分子组装体的种类 ----脂质体/DNA超分子组装体
Fig. 3. Schematic picture of the local arrangement in the interior of lipid-DNA complexes
Construction of the biodegradable multilayer
0.20
Absorbance at 260 nm
0.12 0.10
180 160 140 Thickness (nm) 120 100 80 60 40 20 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
?
细胞内组装体解离
基因转染率无法与病毒载体相比！
交联的聚乙烯亚胺
克服高分子量PEI的 高细胞毒性 保留高分子量PEI的 高转染率
2. 缓释系统
材料：明胶、海藻酸钠、pluronic、PLGA等 原理：最主要的是使得裸DNA在细胞膜表面的浓度 增加，从而提高了DNA对细胞膜的穿透 优点：由于DNA在细胞中是以缓释或控释的途径释 放，增加对细胞膜的穿透，提高转染率
REMEDYTM channel balloon catheter for drug/gene delivery
injection lumen
balloon
inflation lumen
cross-section of balloon
* *
Infusion lumens
an angioplasty balloon is surrounded by separate infusion lumens (*) allowing independent lowpressure drug/gene delivery. The infusion lumen has a set of 24 channels (30 ∝m holes).
星形两亲聚合物能有效诱导质粒DNA的浓缩，降低细胞毒性。
基因传递的途径
细胞外传递 细胞内吞 逃离溶酶体 复合物解离 进攻细胞核
增强细胞内吞和靶向定位 !
1 配体增强超分子组装基因传递体系
Clathrin LDL Particle Cholesterol esters Apo-B protein Phospholipid monolayer
裸质粒DNA：易水解、不利于胞吞 在主要器官中只能实现低层次的表达
具有高效安全和组织特异性的基因 传递体系的研制成为制约基因治疗大规 模临床应用的瓶颈问题之一.
基因传递过程
基因传递的途径
细胞外传递 细胞内吞 逃离溶酶体 复合物解离 进攻细胞核 Fig.2 Schematic drawing of DNA delivery pathways after cell uptake
基因治疗的安全性
病毒载体 vs 非病毒载体
病毒载体： 优点： 转染效率高， 缺点：毒性、免疫原性、靶向性等
1998年美国宾洲大学人类基因治疗中心发生一例使用腺病毒基因治疗 导致死亡的病例后，人们对人体内使用病毒载体的安全性提出了质疑。
非病毒载体：优点： 安全、无毒 缺点：转染率低
非病毒载体
____基因超分子组装体的种类
Science, 1997, 275(5301): 810～814
脂质体及脂类复合物
与基因复合过程容易，非病毒性载体，本身 降解，保护DNA 但与DNA分子混合后不稳定，形成的DNA载体 复合物不易保存，具有细胞毒性, 转染率低
基因超分子组装体的种类 ----聚合物/ DNA超分子组装体
• 壳聚糖、聚赖氨酸（PLL）、聚乙烯亚胺（PEI）、多 肽片段 • 保护DNA分子的生物活性 • 尺寸大小：~ 50-200 nm (DNA = 1.0-2.5 Mb)
QuickTime?遣 TIFF舏鄭鑛腔堑舑 闘恚蓈社蒓赦赡 菣潜敲蓅蒒蒨缮蔷濠侨菫墙菂钦颣髒黔菑臖
血管内腔 心筋組織 ＃ 間質・静脈 心筋
ステント部位
中膜 外膜
采用静电组装技术构建固相基因传递系统
静电组装：一种由带相反电荷的聚电解质在液/固界
面通过静电作用交替沉积形成多层膜的技术。
Enzymatic Biodegradable Self-assembly Multilayer as Gene Delivery System
~50-200 nm + - + - + + +
-
~ 500 nm
-(
NH-CH2CH2 N-CH2CH2 CH2 CH2 NH2
- ) n -(
-) m
聚乙烯亚胺（PEI)
分子量高于25k的PEI: 较高的基因转染率 较高的细胞毒性; 分子量低于1800的PEI: 没有细胞毒性, 不能介导基因转染.
0.08
0.15
0.06
0.04
Absorbance
10 bilayers 0.10 6 bilayers
0.02
0.00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Bilayer N um ber
1 0.05
0.00 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
PLGA微球
水凝胶在基因传递中的应用 Yasuhiko Tabata等做的实验： 实验材料：乙二胺和EDC等制成可生物降解的 水凝胶（CG水凝胶）。 实验内容：将用I125标记的DNA质粒和CG水凝 胶形成复合物，注射到小鼠大腿肌肉内，超声 照射，考察DNA的转染率和表达效率。
水凝胶在气囊导管的应用：水凝胶气囊导管最 早于1993年由Riessen和Isner用于基因转移。它 是由标准血管形成气囊导管与气囊表面包被一 薄层亲水质丙烯酸多聚物组成，后者能将转移 基因贮备其中。当该气囊导管插于基因定位 处，水凝胶在37度发生膨胀，目的基因从凝胶 中释放。
基因传递体系的研究
什么是基因治疗？
将人的正常基因或有治疗作用的基因通过 一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或 者发挥治疗作用, 从而达到治疗疾病目的的生 物医学新技术.
质粒DNA------前体药物(prodrug)
Fig. 1 AFM images of a plasmid DNA(in this case: pBR322,4363bp)
Construction
Biomacromolecules, in press
Deconstruction
The enzymatic biodegradation of multilayer was choose as a pathway to control release of DNA to adhesive cells.
理想的基因传递体系：
• 在体内循环中保持稳定 • 有效到达靶向细胞 • 在靶向细胞内的高效表达
= site of administration = target site(s)
解决基因DNA和载体分子在传递过程中的稳定缔合和在细 胞内的解离、高效释放表达这一对矛盾，是非病毒基因载 体设计中的关键问题之一。
基因传递的途径-----细胞外稳定传递
DNA的浓缩 避免酶解 调解免疫 反应 避免非特异性吸附
基因传递的途径
细胞外传递 细胞内吞 逃离溶酶体 复合物解离 进攻细胞核 Fig.2 Schematic drawing of DNA delivery pathways after cell uptake
• 改善聚阳离子/DNA复合物 水中稳定性 • 改善聚阳离子/DNA复合物 冷冻干燥稳定性 • 提高转染率
两亲超分子组装基因传递体系
PEI链段
PEG链段 Kissel等研究了星形两亲聚合物/DNA组装行为的研 究。
Biomacromolecules, 2002, 3 (5): 926 ～936
Fig. 4 AFM images of the plasmid DNA complexes formed with homopolymer PEI and copolymers 8- star-[PEG(10k)- block-PEI]. The images of the DNA condensates containing the PEI 800 and 2000 Da homopolymers have a z-range of 150 nm, all other images have a z-range of 20nm. All scale bars are equal to 2µm.
Immediately after stent implantation nanoparticle solution (40 mg, 1 ml) was infused at 3 atm with REMEDY catheter. Fluorescence picture of coronary artery 7 days after stenting and nanoparticle infusion.
基因传递的途径-----细胞内吞
吸附内吞(adsorptive endocytosis):
负电荷的细胞膜 正电荷的基因组装体
受体介导内吞(receptor- mediated endocytosis)：
配体增强的基因超分子组装体
基因传递的途径
细胞外传递 细胞内吞 逃离溶酶体 复合物解离 进攻细胞核
靶
向
配
体
靶
向
细
胞
半乳糖、去唾液酸糖蛋白 叶酸、上皮生长因子（EGF) 转铁蛋白 甘露糖
肝细胞 癌细胞 造血细胞、癌细胞 巨噬细胞
基因传递的途径
细胞外传递 细胞内吞 逃离溶酶体 复合物解离 进攻细胞核
两亲超分子组装基因传递体系
提高体内循环中的稳定性 延长体内循环时间 减少细胞毒性 一对矛盾 细胞外稳定缔合 基因转染率有所提高
体外稳定缔合和细胞毒性间的矛盾!
改进方法---两亲超分子组装基因传递体系
聚阳离子链段: 诱导DNA的浓缩 非离子的亲水性链段：提高体内循环中的稳定性 延长体内循环时间 减少细胞毒性 从而提高基因传递体系的转染率
基因：DNA/聚赖氨酸-嵌-聚乙二醇 （PLL-b-PEG)复合物胶束
PEGylated polycations for gene delivery
This delivery catheter is useful for drug/gene delivery to target vascular lesions in combination with nanotechnology based-DDS.
Delivery of FITC-encapsulated nanoparticles to stented coronary artery with REMEDY catheter
11
基因传递方式和基因传递材料
病毒载体：小病毒类、腺病毒、逆后病毒、 斑病毒、疱疹病毒等 基因 传递 物理方法：DNA直接注射、基因枪、电脉冲介导法 非病毒载体： DNA-磷酸钙共沉淀法得到的沉淀颗粒体系 脂质体及脂类复合物 高分子聚合物
wk.baidu.com
基因传递的物理方法 ：比较直接
但 DNA直接注射——目的基因很难整合进染色体中 基因枪——仅使金属颗粒深入组织中几毫米， 限制其应用 电脉冲介导法——局部的细胞损害和炎症反应
Background
Proteolysis of the ECM is crucial first step in the mechanism of tumor cell invasion and vascular remodeling.
Proteolytically degradable films may have especially useful properties in gene therapy and tissue engineering.
Cell Membrane Clathrin polymerization / Vessicle formation
Lysosome Early Endosome
Lysosomal Degradation
Receptor Recycle Late Endosome
Classic Example: Low-Density Lipoprotein (LDL)
基因超分子组装体的种类 ----脂质体/DNA超分子组装体
Fig. 3. Schematic picture of the local arrangement in the interior of lipid-DNA complexes
Construction of the biodegradable multilayer
0.20
Absorbance at 260 nm
0.12 0.10
180 160 140 Thickness (nm) 120 100 80 60 40 20 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
?
细胞内组装体解离
基因转染率无法与病毒载体相比！
交联的聚乙烯亚胺
克服高分子量PEI的 高细胞毒性 保留高分子量PEI的 高转染率
2. 缓释系统
材料：明胶、海藻酸钠、pluronic、PLGA等 原理：最主要的是使得裸DNA在细胞膜表面的浓度 增加，从而提高了DNA对细胞膜的穿透 优点：由于DNA在细胞中是以缓释或控释的途径释 放，增加对细胞膜的穿透，提高转染率
REMEDYTM channel balloon catheter for drug/gene delivery
injection lumen
balloon
inflation lumen
cross-section of balloon
* *
Infusion lumens
an angioplasty balloon is surrounded by separate infusion lumens (*) allowing independent lowpressure drug/gene delivery. The infusion lumen has a set of 24 channels (30 ∝m holes).
星形两亲聚合物能有效诱导质粒DNA的浓缩，降低细胞毒性。
基因传递的途径
细胞外传递 细胞内吞 逃离溶酶体 复合物解离 进攻细胞核
增强细胞内吞和靶向定位 !
1 配体增强超分子组装基因传递体系
Clathrin LDL Particle Cholesterol esters Apo-B protein Phospholipid monolayer
裸质粒DNA：易水解、不利于胞吞 在主要器官中只能实现低层次的表达
具有高效安全和组织特异性的基因 传递体系的研制成为制约基因治疗大规 模临床应用的瓶颈问题之一.
基因传递过程
基因传递的途径
细胞外传递 细胞内吞 逃离溶酶体 复合物解离 进攻细胞核 Fig.2 Schematic drawing of DNA delivery pathways after cell uptake
基因治疗的安全性
病毒载体 vs 非病毒载体
病毒载体： 优点： 转染效率高， 缺点：毒性、免疫原性、靶向性等
1998年美国宾洲大学人类基因治疗中心发生一例使用腺病毒基因治疗 导致死亡的病例后，人们对人体内使用病毒载体的安全性提出了质疑。
非病毒载体：优点： 安全、无毒 缺点：转染率低
非病毒载体
____基因超分子组装体的种类
Science, 1997, 275(5301): 810～814
脂质体及脂类复合物
与基因复合过程容易，非病毒性载体，本身 降解，保护DNA 但与DNA分子混合后不稳定，形成的DNA载体 复合物不易保存，具有细胞毒性, 转染率低
基因超分子组装体的种类 ----聚合物/ DNA超分子组装体
• 壳聚糖、聚赖氨酸（PLL）、聚乙烯亚胺（PEI）、多 肽片段 • 保护DNA分子的生物活性 • 尺寸大小：~ 50-200 nm (DNA = 1.0-2.5 Mb)
QuickTime?遣 TIFF舏鄭鑛腔堑舑 闘恚蓈社蒓赦赡 菣潜敲蓅蒒蒨缮蔷濠侨菫墙菂钦颣髒黔菑臖
血管内腔 心筋組織 ＃ 間質・静脈 心筋
ステント部位
中膜 外膜
采用静电组装技术构建固相基因传递系统
静电组装：一种由带相反电荷的聚电解质在液/固界
面通过静电作用交替沉积形成多层膜的技术。
Enzymatic Biodegradable Self-assembly Multilayer as Gene Delivery System
~50-200 nm + - + - + + +
-
~ 500 nm
-(
NH-CH2CH2 N-CH2CH2 CH2 CH2 NH2
- ) n -(
-) m
聚乙烯亚胺（PEI)
分子量高于25k的PEI: 较高的基因转染率 较高的细胞毒性; 分子量低于1800的PEI: 没有细胞毒性, 不能介导基因转染.
0.08
0.15
0.06
0.04
Absorbance
10 bilayers 0.10 6 bilayers
0.02
0.00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Bilayer N um ber
1 0.05
0.00 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
PLGA微球
水凝胶在基因传递中的应用 Yasuhiko Tabata等做的实验： 实验材料：乙二胺和EDC等制成可生物降解的 水凝胶（CG水凝胶）。 实验内容：将用I125标记的DNA质粒和CG水凝 胶形成复合物，注射到小鼠大腿肌肉内，超声 照射，考察DNA的转染率和表达效率。
水凝胶在气囊导管的应用：水凝胶气囊导管最 早于1993年由Riessen和Isner用于基因转移。它 是由标准血管形成气囊导管与气囊表面包被一 薄层亲水质丙烯酸多聚物组成，后者能将转移 基因贮备其中。当该气囊导管插于基因定位 处，水凝胶在37度发生膨胀，目的基因从凝胶 中释放。
基因传递体系的研究
什么是基因治疗？
将人的正常基因或有治疗作用的基因通过 一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或 者发挥治疗作用, 从而达到治疗疾病目的的生 物医学新技术.
质粒DNA------前体药物(prodrug)
Fig. 1 AFM images of a plasmid DNA(in this case: pBR322,4363bp)
Construction
Biomacromolecules, in press
Deconstruction
The enzymatic biodegradation of multilayer was choose as a pathway to control release of DNA to adhesive cells.
理想的基因传递体系：
• 在体内循环中保持稳定 • 有效到达靶向细胞 • 在靶向细胞内的高效表达
= site of administration = target site(s)
解决基因DNA和载体分子在传递过程中的稳定缔合和在细 胞内的解离、高效释放表达这一对矛盾，是非病毒基因载 体设计中的关键问题之一。
基因传递的途径-----细胞外稳定传递
DNA的浓缩 避免酶解 调解免疫 反应 避免非特异性吸附
基因传递的途径
细胞外传递 细胞内吞 逃离溶酶体 复合物解离 进攻细胞核 Fig.2 Schematic drawing of DNA delivery pathways after cell uptake
• 改善聚阳离子/DNA复合物 水中稳定性 • 改善聚阳离子/DNA复合物 冷冻干燥稳定性 • 提高转染率
两亲超分子组装基因传递体系
PEI链段
PEG链段 Kissel等研究了星形两亲聚合物/DNA组装行为的研 究。
Biomacromolecules, 2002, 3 (5): 926 ～936
Fig. 4 AFM images of the plasmid DNA complexes formed with homopolymer PEI and copolymers 8- star-[PEG(10k)- block-PEI]. The images of the DNA condensates containing the PEI 800 and 2000 Da homopolymers have a z-range of 150 nm, all other images have a z-range of 20nm. All scale bars are equal to 2µm.
Immediately after stent implantation nanoparticle solution (40 mg, 1 ml) was infused at 3 atm with REMEDY catheter. Fluorescence picture of coronary artery 7 days after stenting and nanoparticle infusion.
基因传递的途径-----细胞内吞
吸附内吞(adsorptive endocytosis):
负电荷的细胞膜 正电荷的基因组装体
受体介导内吞(receptor- mediated endocytosis)：
配体增强的基因超分子组装体
基因传递的途径
细胞外传递 细胞内吞 逃离溶酶体 复合物解离 进攻细胞核
靶
向
配
体
靶
向
细
胞
半乳糖、去唾液酸糖蛋白 叶酸、上皮生长因子（EGF) 转铁蛋白 甘露糖
肝细胞 癌细胞 造血细胞、癌细胞 巨噬细胞
基因传递的途径
细胞外传递 细胞内吞 逃离溶酶体 复合物解离 进攻细胞核
两亲超分子组装基因传递体系
提高体内循环中的稳定性 延长体内循环时间 减少细胞毒性 一对矛盾 细胞外稳定缔合 基因转染率有所提高
体外稳定缔合和细胞毒性间的矛盾!
改进方法---两亲超分子组装基因传递体系
聚阳离子链段: 诱导DNA的浓缩 非离子的亲水性链段：提高体内循环中的稳定性 延长体内循环时间 减少细胞毒性 从而提高基因传递体系的转染率
基因：DNA/聚赖氨酸-嵌-聚乙二醇 （PLL-b-PEG)复合物胶束
PEGylated polycations for gene delivery
This delivery catheter is useful for drug/gene delivery to target vascular lesions in combination with nanotechnology based-DDS.
Delivery of FITC-encapsulated nanoparticles to stented coronary artery with REMEDY catheter
11
基因传递方式和基因传递材料
病毒载体：小病毒类、腺病毒、逆后病毒、 斑病毒、疱疹病毒等 基因 传递 物理方法：DNA直接注射、基因枪、电脉冲介导法 非病毒载体： DNA-磷酸钙共沉淀法得到的沉淀颗粒体系 脂质体及脂类复合物 高分子聚合物
wk.baidu.com
基因传递的物理方法 ：比较直接
但 DNA直接注射——目的基因很难整合进染色体中 基因枪——仅使金属颗粒深入组织中几毫米， 限制其应用 电脉冲介导法——局部的细胞损害和炎症反应
Background
Proteolysis of the ECM is crucial first step in the mechanism of tumor cell invasion and vascular remodeling.
Proteolytically degradable films may have especially useful properties in gene therapy and tissue engineering.
Cell Membrane Clathrin polymerization / Vessicle formation
Lysosome Early Endosome
Lysosomal Degradation
Receptor Recycle Late Endosome
Classic Example: Low-Density Lipoprotein (LDL)