基因编辑技术

第四节 重组DNA技术常用载体
一、定义
是指能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的 一类DNA分子。
分类： 克隆载体：用于在宿主细胞中克隆和扩增外
源DNA片段。 表达载体：用于在宿主细胞中获得外源基因
表达产物。
二、特点
1、具备复制能力。 2、具备一个或多个筛选标志。 3、具备较多拷贝数，易从宿主细胞中分离纯化。 4、具备一个或多个限制性内切酶的单一识别点（多
大肠杆菌连接酶，只能连接粘性末端，T4噬菌体连接酶不 但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。
ACG-OH TACTTAA-P
P-AATTCGT OH-GCA
ห้องสมุดไป่ตู้
-ACGAATTCGT-TGCTTAAGCA
3、DNA聚合酶
具有5`→3`聚合活性、5`→3`外切酶活性、3`→5`外 切酶活性。
可用于合成双链cDNA分子或片断连接，探针制备，序 列分析等。
理论上讲，这些重组载体 上带有了该生物体的全部基 因，称为基因文库。
(3)构建cDNA文库：
(4)聚合酶链反应（PCR） 已知目的基因的基因序列，用PCR从基因组
DNA中获得目的基因，或用逆转录PCR方法直接 从mRNA获得特定基因的cDNA。
(5)直接用限制性内切酶切取、分离： 对一些物理图谱已经确定，背景资料
5、末端转移酶 催化单脱氧核苷酸转移到DNA3`-端羟基上。 应用：探针标记，标记测序以及制备人工黏性末端。
6、T4多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5ˊ羟基末端磷酸化。 用途：⑴放射性标记DNA的5`端
⑵使缺少5`-磷酸基的DNA磷酸化用于连接反应。 7、S1核酸酶
单链核酸内切酶，降解单链DNA或RNA。
识别位点：即为Ⅱ型酶识别的特殊DNA序列 。
通常是4～8个碱基对、具有回文序列的DNA片段
5’ – G A A T T C - 3’ 3’ – C T T A A G - 5’
① 5`突出粘性末端 ② 3`突出粘性末端 ③ 平头（钝性末端）
2、DNA连接酶
催化DNA中相邻的5ˊ端磷酸基和3ˊ-OH末端之间形成 3ˊ→5ˊ磷酸二酯键。
第三节 工具酶
1、 “基因剪刀”－限制性核酸内切酶
Werner Arber 理论预见限制酶
Hamilton O. Smith Daniel Nathans 得到第一个限制酶 用限制酶切得
SV40 DNA片断
1978年Nobel生理或医学奖
1.定义：能识别双链DNA分子中某特定的核苷酸序列，并 在识别序列内或附近切割DNA双链结构的一类核 酸内切酶（在核酸分子链的内部制造切口的酶）。
基本步骤
1、 制备目的基因
（1）化学合成： 已知目的基因的核苷酸序列或根据基因产物的氨基酸序
列推导出相应基因DNA碱基序列。
目前使用DNA合成仪合成的片段长度有限，一般用于小 分子活性多肽基因的合成，较长的链则须分段合成，然后用 连接酶加以连接。
（2）构建基因组DNA文库：
将某种生物细胞的整个基 因组DNA用物理或酶学的方法 切割成预期大小的片断，并将 所有这些片断都与适当的载体 连接，引入相应的宿主细胞中 保存和扩增。
耐热DNA聚合酶 最适反应温度为75～80℃ 具有5ˊ→3ˊ外切酶活性，不具有3ˊ→5ˊ外切酶活性
4、碱性磷酸酶
去除DNA、RNA、dNTP和NTP 5ˊ端的磷酸根。
（1）5’端标记 （2）制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身
连接，提高重组效率。 碱性磷酸酶有细菌碱性磷酸酶（BAP）和牛小肠碱性磷酸 酶（CIP）。CIP能在 1% SDS溶液中68 ℃加热15 min而 失活，故CIP较为常用。
又称为分子克隆技术或基 因工程技术
第二节 重组DNA技术的发展史
基因工程的诞生
1、Berg的开创性实验－第一个实现DNA重组 猴病毒SV40的DNA+λ噬菌体的DNA
1980年Nobel化学奖
2、Boyer-Cohen实验－第一个取得基因工程成功 1973年构建双重抗药性重组质粒 1973年是基因工程诞生的元年
2.来源：原核生物
3.分类：根据结构、作用特点不同，分为三类。
Ⅰ型酶、Ⅲ型酶： 具有限制切割与甲基化修饰活性。Ⅰ型和Ⅲ型酶都没
有多大的实用价值。
Ⅱ型酶： 应用广泛，能在DNA分子内部的特异位点，识别和切
割双链DNA，其切割位点的序列可知、固定。 通常所说的限制性内切酶就是指Ⅱ型酶。
4.识别和切割位点：
克隆位 点，MCS）。
5、具有较高的遗传稳定性。
3、常用载体
质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA、酵母DNA
这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋 予一些新的功能：如有利于进行筛选的标志基因、单一 的限制酶切点等。
1、质粒（plasmid）:
质粒为细菌染色体之外一些能独立复制并保持稳定 遗传的复制子。结构上，它是一种双链闭合环状的 DNA分子。
CELLECTIS S.A. NASDAQ
2015.11.18 DNA剪切技术治疗1岁女童获成功
基因组编辑技术简介
Genome Editing
2015.11.22 HuangCH @ J208
修改遗传信息的第一步： 按我们的设计来重组DNA
第一节 基 本 概 念
重组DNA技术：
是指在基因水平上，将目 的DNA在体外重组于能自我复制 的载体DNA分子上，然后将重组 DNA导入宿主细胞中进行增生， 以获得大量的目的DNA片段，或 以此为基础，通过基因的诱导 表达，得到大量相应蛋白质产 物的过程。
pBR322质粒载体 ①相对分子质量小，长度为4.3kb。 ②含有氨苄青霉素和四环素的抗性 基因(Ampr和Tetr)。 ③有24种限制性内切酶位点。 ④有一个复制起始点（ori）及与 DNA复制有关的序列，赋予该质粒 复制子特性。 ⑤为松弛型复制子。
2、噬菌体（bacteriophage,phage)
是感染细菌的一类病毒 ，寄生于细菌中，并能溶解 细菌细胞，故称噬菌体。
噬 菌 体 生 活 周 期
3、酵母 酵母人工染色体（YAC）：用于大片段DNA的克隆。
4、病毒
第五节 重组DNA技术
目的基因的获取
↓
克隆载体的选择
↓
目的基因与载体 连接成重组DNA
↓
重组DNA导入受体菌
↓
重组体的筛选
↓
克隆基因的表达