实验碱性磷酸酶米氏常数的测定
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1．原理 Beer-Lambert（比尔）定律：
T=I/I0 A=lg1/T=lgI0/I
A=KCL 其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射
光强度；I为透射光强度； K为吸收系数；C为溶液浓度；L为溶液光
程的厚度
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2．常用方法 （1）标准曲线法
OD或Ａ
浓度
标准曲线与样品的测定条件必须一致。
碳酸盐缓冲液（mL ）
20 mmol/L MgCl2 （mL ） 预热
各加1.0 mL 各加0.2 mL 混匀，37℃，5分钟
酶液（mL ） 反应时间
测定管各加0.2 Байду номын сангаасL酶液 37℃，精确反应10分钟
0.1 mol/L NaOH（mL）
各加2 mL
酶液（mL ）
空白管各补加0.2 mL酶液
OD405
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四、分光光度计的使用
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1．722型分光光度计的外形
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2.仪器操作键介绍 “方式设定”键（MODE）：用于设置测 试方式 “100%T/0ABS”键：用于自动调整 100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度) “0%T”键：用于自动调整零透射比 “波长设置”旋钮：用于设置分析波长
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（三） 数据处理
各管在722分光光度计测定波长405nm的OD 值 (OD405nm) 。 从 对 硝 基 苯 酚 标 准 曲 线 上 查 出 OD405nm相当于产物对硝基苯酚的含量(mol数), 计 算 出 各 种 底 物 浓 度 下 的 初 速 度 vo （ 单 位 以 molL-1min-1表示），取倒数1/v填入表内。以 1/v对1/[S]作图，求出酶催化pNPP水解的米氏常 数Km和最大反应速度Vm。
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3.样品测试操作
① 打开电源开关，使仪器预热20分钟
② 用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波 长位置上
③ 打开样品室盖，将挡光体插入比色皿架，并将其推或拉 入光路
④ 盖好样品室盖，按“0%T”键调透射比零
⑤ 取出挡光体，盖好样品室盖，按“100%T”调100%透射 比
H2O (mL)
0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2
Na2CO3-NaHCO3 (mL)
各管加入1.0 mL
20 mmol/L MgCl2 (mL) 各管加入0.2 mL
0.1 mol/L NaOH (mL) 各管加入2.0 mL
OD 405 nm
以对硝基苯酚的绝对量(mol数)为横坐标，OD405nm值为纵坐标， 绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数()值。
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(二）测定 15支试管，1-5做两组平行测定管，01-05作为空白对照。
No. 底物终浓度[S] (mM )
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4
5
0.5 0.75 1.0 1.5 3
10 mmol/L pNPP（mL ） 0.1 0.15 0.2 0.3 0.6
蒸馏水（mL ）
0.5 0.45 0.4 0.3 0
实验五 碱性磷酸酶米氏常数 的测定
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一、目的要求
1.学习分光光度法测定的原理和方法 2.学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度
（Vm）的测定原理和方法，测出碱性磷酸酶 在以对硝基苯酚磷酸为底物时的Km 和Vm值。
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二、原理
一、分光光度法的基本原理及方法 （一）利用吸收光谱对物质进行定性分析
1．原理
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2．主要方法： （1）比较吸收光谱曲线 （2）比较最大吸收波长
蛋白质的最大吸收波长为280nm，核酸的最大吸收波长 为260nm。
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1.苯丙氨酸 2.酪氨酸 3.色氨酸
（3）比较吸光度的比值
纯DNA
A260nm 1.8 A280nm
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（二）利用吸收光谱对物质进行定量分析
⑥ 按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度方式
(A)
⑦ 将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中
⑧ 打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽 中，盖上样品室盖
⑨ 将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”调零A
⑩ 将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测
样品的吸光度参数
实验完成后，关闭电源，洗医学净课比件p色pt 皿，并盖好盖布。
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（2）标准管法
CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX，可 求得CX。 （3）摩尔吸光系数法
C=A/（为L=1cm，C为1 mol/L时的 吸光系数，也称为摩尔吸光系数。
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(三)米氏常数的测定原理
酶促反应v-[S]曲线
v
[S]
推导出米氏方程为：
v Vm[S] Km [S]
氏方程转化为倒数形式，即：
1 Km 1 1 v Vm [S] Vm
以1/v对1/[S]作图，可得一条直线
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1/v
1/Vm
-1/Km
1/[S]
本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pNPP)
水解的Km和Vm.
反应式：pNPP+H2O
pNP+HPO42-
无色
黄色
可通过分光光度法测定产物pNP的含量，求出反应速度
其中[S]为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度； Km 为米氏常数
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米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含 着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能 够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反 映出酶与各种底物的亲和力的强弱。
测定Km和Vm，可通过作图法求得。 最常用的 Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米
v。
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三、试剂与器材
试剂： 0.5mol/mL pNP 、10 mmol/L pNPP、20 mmol/L MgCl2、0.1 mol/L 碳酸钠—碳酸氢钠 pH 10.1缓冲液、0.1 mol/L NaOH、6 g/mL碱性磷酸 酶酶液
器材：恒温水浴锅、722分光光度计
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五、操作方法
（一）对硝基苯酚标准曲线的制作
取5支试管编号,0号一支,1－7号各二支,按下表操作：
管号
0 12 3 4 5 6
pNP含量 (mol)
0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30
0.5mol/mL pNP (mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
T=I/I0 A=lg1/T=lgI0/I
A=KCL 其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射
光强度；I为透射光强度； K为吸收系数；C为溶液浓度；L为溶液光
程的厚度
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2．常用方法 （1）标准曲线法
OD或Ａ
浓度
标准曲线与样品的测定条件必须一致。
碳酸盐缓冲液（mL ）
20 mmol/L MgCl2 （mL ） 预热
各加1.0 mL 各加0.2 mL 混匀，37℃，5分钟
酶液（mL ） 反应时间
测定管各加0.2 Байду номын сангаасL酶液 37℃，精确反应10分钟
0.1 mol/L NaOH（mL）
各加2 mL
酶液（mL ）
空白管各补加0.2 mL酶液
OD405
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四、分光光度计的使用
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1．722型分光光度计的外形
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2.仪器操作键介绍 “方式设定”键（MODE）：用于设置测 试方式 “100%T/0ABS”键：用于自动调整 100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度) “0%T”键：用于自动调整零透射比 “波长设置”旋钮：用于设置分析波长
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（三） 数据处理
各管在722分光光度计测定波长405nm的OD 值 (OD405nm) 。 从 对 硝 基 苯 酚 标 准 曲 线 上 查 出 OD405nm相当于产物对硝基苯酚的含量(mol数), 计 算 出 各 种 底 物 浓 度 下 的 初 速 度 vo （ 单 位 以 molL-1min-1表示），取倒数1/v填入表内。以 1/v对1/[S]作图，求出酶催化pNPP水解的米氏常 数Km和最大反应速度Vm。
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3.样品测试操作
① 打开电源开关，使仪器预热20分钟
② 用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波 长位置上
③ 打开样品室盖，将挡光体插入比色皿架，并将其推或拉 入光路
④ 盖好样品室盖，按“0%T”键调透射比零
⑤ 取出挡光体，盖好样品室盖，按“100%T”调100%透射 比
H2O (mL)
0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2
Na2CO3-NaHCO3 (mL)
各管加入1.0 mL
20 mmol/L MgCl2 (mL) 各管加入0.2 mL
0.1 mol/L NaOH (mL) 各管加入2.0 mL
OD 405 nm
以对硝基苯酚的绝对量(mol数)为横坐标，OD405nm值为纵坐标， 绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数()值。
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(二）测定 15支试管，1-5做两组平行测定管，01-05作为空白对照。
No. 底物终浓度[S] (mM )
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0.5 0.75 1.0 1.5 3
10 mmol/L pNPP（mL ） 0.1 0.15 0.2 0.3 0.6
蒸馏水（mL ）
0.5 0.45 0.4 0.3 0
实验五 碱性磷酸酶米氏常数 的测定
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一、目的要求
1.学习分光光度法测定的原理和方法 2.学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度
（Vm）的测定原理和方法，测出碱性磷酸酶 在以对硝基苯酚磷酸为底物时的Km 和Vm值。
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二、原理
一、分光光度法的基本原理及方法 （一）利用吸收光谱对物质进行定性分析
1．原理
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2．主要方法： （1）比较吸收光谱曲线 （2）比较最大吸收波长
蛋白质的最大吸收波长为280nm，核酸的最大吸收波长 为260nm。
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1.苯丙氨酸 2.酪氨酸 3.色氨酸
（3）比较吸光度的比值
纯DNA
A260nm 1.8 A280nm
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（二）利用吸收光谱对物质进行定量分析
⑥ 按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度方式
(A)
⑦ 将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中
⑧ 打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽 中，盖上样品室盖
⑨ 将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”调零A
⑩ 将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测
样品的吸光度参数
实验完成后，关闭电源，洗医学净课比件p色pt 皿，并盖好盖布。
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（2）标准管法
CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX，可 求得CX。 （3）摩尔吸光系数法
C=A/（为L=1cm，C为1 mol/L时的 吸光系数，也称为摩尔吸光系数。
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(三)米氏常数的测定原理
酶促反应v-[S]曲线
v
[S]
推导出米氏方程为：
v Vm[S] Km [S]
氏方程转化为倒数形式，即：
1 Km 1 1 v Vm [S] Vm
以1/v对1/[S]作图，可得一条直线
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1/v
1/Vm
-1/Km
1/[S]
本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pNPP)
水解的Km和Vm.
反应式：pNPP+H2O
pNP+HPO42-
无色
黄色
可通过分光光度法测定产物pNP的含量，求出反应速度
其中[S]为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度； Km 为米氏常数
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米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含 着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能 够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反 映出酶与各种底物的亲和力的强弱。
测定Km和Vm，可通过作图法求得。 最常用的 Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米
v。
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三、试剂与器材
试剂： 0.5mol/mL pNP 、10 mmol/L pNPP、20 mmol/L MgCl2、0.1 mol/L 碳酸钠—碳酸氢钠 pH 10.1缓冲液、0.1 mol/L NaOH、6 g/mL碱性磷酸 酶酶液
器材：恒温水浴锅、722分光光度计
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五、操作方法
（一）对硝基苯酚标准曲线的制作
取5支试管编号,0号一支,1－7号各二支,按下表操作：
管号
0 12 3 4 5 6
pNP含量 (mol)
0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30
0.5mol/mL pNP (mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6