大豆分离蛋白的提取实验讲义

实验一大豆分离蛋白的提取

1．实验目的

学习掌握大豆分离蛋白的碱提酸沉法。

2．分离原理：

大豆分离蛋白的制取方法，按工艺特点主要有三种：第一种是碱提酸沉法；第二种是离子交换法；第三种是超滤法。

碱提酸沉法生产大豆分离蛋白的原理，是将脱脂大豆内的蛋白质溶解在稀碱溶液中，分离除去豆粕中的不溶物，然后用酸将大豆蛋白质提取液的pH值调至大豆蛋白的等电点，使大豆蛋白质沉淀析出，再经分离清洗，回调pH，得到粉状大豆分离蛋白。

3. 试剂材料：豆粕，5%NaOH，2N HCl（17ml浓盐酸，缓慢用水稀释至100ml）。

4. 提取方法：

将2g大豆磨碎，得到可通过80目筛的豆粕。用重量10倍于豆粕的蒸馏水与脱脂豆粉混合，用5%NaOH 水溶液将豆粉悬浮液的pH调节到8.5，室温或40℃搅拌1.5h。然后将提取液离心除渣4000rpm×15min，得上清液。用2N的HCl将上清液的pH值调到4.5，同时轻度搅拌均匀，可见开始出现沉淀，室温静置30min，然后以4000rpm×15min离心，用蒸馏水清洗沉淀2次，将蛋白沉淀物溶于20 ml水中，并调节pH到7.0，考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度，计算蛋白提取率。

5. 产品测定指标：

（1）可溶性蛋白质的浓度：采用考马斯亮蓝法。

（2）蛋白质的提取率计算公式：

可溶蛋白质的浓度(ug/ml) ×稀释度×体积(ml)

提取率（%）＝×100%

原料质量(g) ×106

（附）考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度

一、实验目的

掌握考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度的原理和方法，掌握离心机和移液器的正确使用方法。

二、实验原理

考马斯亮蓝G-250是一种甲基取代的三苯基甲烷，在465nm处有最大吸收值。考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成蛋白质-考马斯亮蓝复合物蓝色溶液，引起该染料的最大吸收λmax的位置发生转移，在595nm处有最大吸收值。在一定范围内(蛋白质浓度范围为0～1000μg／mL)，蛋白质-考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。

该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还

高4倍，可测定微克级蛋白质含量，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

三、实验试剂

1．标准蛋白液：准确称取100mg牛血清白蛋白，用蒸馏水溶解并定容至1000ml，制成100μg /ml 的原液。

2．考马斯亮蓝G250试剂：准确称取100mg考马斯亮蓝G250，溶于50ml 90％～95％乙醇中，再加入85%磷酸（m/v）100ml，用蒸馏水定容至1000ml。常温下可放置1个月。

四、操作步骤

1．标准曲线的制备

取7支具塞试管，按下表进行编号并加入试剂。以第1管为空白，于波长595nm处比色，读取吸光度，以吸光度为纵坐标，各标准液浓度(μg／mL)作为横坐标作图得标准曲线。

2．样品中蛋白质含量的测定

根据样品吸光度值，推出样品中蛋白质含量。

七、注意事项

1．样品蛋白质含量应在10～100ug为宜。一些阳离子如K+、Na+、Mg2+、（NH4）2SO4、乙醇等物质对测定无影响，而大量的去污剂如TritonX-100、SDS等会严重干扰测定。

2．蛋白质与考马斯亮蓝G250结合十分迅速，在2min左右即可达到平衡，其结合物在室温下1h内保持稳定，且在5min～20min之间颜色稳定性最好。

3．试管内溶液要充分混合，但应避免不正确的振荡而产生大量的气泡。

4．染料易吸附在比色杯上（注意尽量不用石英比色杯），比色杯用后可用乙醇洗去蓝色。

5．由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用r-球蛋白质为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。