Menke体外产气法

Menke体外产气法（Syringe系统）——管子
（一）基础知识
体外产气法主要理念通过体外产气装置模拟瘤胃发酵
体外产气系统组成体外产气装置：产气管（相当于独立的瘤胃）、恒温水浴摇床（模
拟瘤胃温度和蠕动速度）；微生物培养液：由瘤胃液与人工唾液按
1:2的体积比混合，搅拌均匀而成
影响实验成败的主要因素实验过程中产气装置的温度，整个操作过程的厌氧状态、微生物
活力是影响实验成败的关键
（二）试验前准备
试配产气管①更换注入口处老化的塑胶管；②试配外管和内塞，要求推拉自如又不过松（现已将可匹配的外管和内塞统一编号，依号装配即可）。

称量样品①产气管编号；②用自制的带长柄的称量纸，准确称取待测样品约200mg（DM），置于体外产气管底部，注意不要让样品进入产气管注入口和沾染30ml以上管壁；③样品称取完毕后，管塞上均匀涂抹凡士林，将管塞塞回对映的外管，扣好夹子。

配制原液正式实验前一天，配制好人工唾液中的微量元素溶液（A液）、缓冲液（B液）、常量元素溶液（C液）和刃天青溶液（D液）（可过量配制，常温下存放，配制方法见附表1）。

其它①调试恒温水浴摇床的温度至39±0.5℃，摇动速度5×10转/min，如果使用两个恒温水浴摇床要求两者温度和摇动速度尽量一致，另外还需要将一多联水浴锅温度调至39±0.5℃（以实际量取温度为准）；②准备二层、四层、六层纱布各2-4块（纱布可重复使用）；③贮备两瓶热水，准备收集瓶（收集和过滤瘤胃液用）、水桶、温度计，以备次日取瘤胃液用。

（三）正式试验
配制人工唾液①将恒温水浴摇床、多联水浴锅打开后；②计算人工唾液需要量：体外培养时每根产气管内微生物培养液的体积是30ml（10ml瘤胃液和20ml人工唾液），依据试验设计的产气管数计算人工唾液和瘤胃液的需要量（预留20%，以备操作手法不当造成浪费）；③配制还原剂（E液，见附表1）；④按附表2的顺序和比例将配制好的各原液混合后，置入水浴摇床或水浴锅内，通入CO2气体（气流不易过大），使人工唾液由蓝色转变为粉红色，最终为无色。

采集与处理瘤胃液为方便读取12h产气量，瘤胃液最好在7:30前取回。

所取瘤胃液为早饲前2h瘤胃液。

①到牧场后，将热水倒入水桶，调节水温度至39±0.5℃，用于瘤胃液保温（应经常用热水调节）；②用真空泵抽取三只湖羊的瘤胃液，混合，倒入收集瓶（注意盖上瓶盖，以防氧气对微生物的影响）；③回到实验室后，将收集瓶置于水浴锅内，四层纱布过滤（应尽量快，以保持微生物的活力），获得的滤液用CO2气体饱和；④用量筒量取所需量的无色人工唾液和瘤胃液混合，不间断地通入CO2气体。

吸取微生物培养液用空的产气管吸取微生物培养液30ml，通过三通管推入已经装有样品的产气管。

记录初始微生物培养液量排气过程：将注入口处夹子打开的同时，用手下拉管塞，以防样品冲入塑胶管；摇晃产气管使样品与瘤胃液混合后，旋转管塞，排出管内空气；读数：将产气管竖直，注入口向下，读取刻度。

排气后的产气管应随机置于恒温水浴摇床内培养（摇床在操作过程中处于摇动状态，以免温度上升）。

空白对照和标准对照
实验过程中要有至少3个空白对照和3个标准干草对照（样多时，对照一定要多，尤其是空白对照）。

空白对照不加样品直接加入30ml 微生物培养液，标准干草对照以200mg （DM ）干草（优质的过80目筛的羊草）为底物，加入30ml 微生物培养液。

为了消除操作顺序和恒温水浴摇床条件的差异，要求空白对照和标准对照平均分布于试验前期、中期和后期，放置于水浴摇床的不同位置。

记录产气量 培养2、4、6、9、12、24、36、48、72、96h 时（试验样品为粗料，一般培养
到72h 或96h ；精料一般培养到24h 或48h 即可终止培养，若要计算产气常数，一般要72h ），记录产气管的刻度读数（读数时轻摇产气管，旋动管塞后读数，读数时，以管塞刻度的中部为准）。

如果产气量过多，下一时间点产气量可能超出刻度范围，则需放气，其操作与排气相同。

产气量计算 ()[]空白t t GP V V W
GP --⨯=0200（管子）
式中，GP t 为样品在t 时刻的产气量（ml ）；V t 为样品发酵t 小时后，产气管刻度读数（ml ）；V 0为样品在开始培养时产气管刻度读数（ml ）；W 为样品干物质重（mg ）；GP 空白为空白对照在t 时刻的产气量，其计算方式与GP t 一致。

重复试验 要求体外产气试验至少培养两次，两次标准干草产气量相对偏差小于10%（若标准
干草产气量与实验室积累的平均值29.5相差太大，应考虑重作，检查动物状况）。

(四)样品采集
测定项目 取样时间 取样部位 取样量 重复数 处理
保存温度 VFA 实际需要 上清液 1ml - 加入0.2ml 8.2%偏磷酸，
20000g 离心10min
4℃ NH 3-N 24或48h 混合液 5ml - -20℃ MCP
24或48h
混合液
24ml
-
-20℃
附表1：人工唾液原液配制表 A 、微量元素溶液：
CaCl 2.2H 2O 13.2g; MnCl 2.4H 2O 10.0g; CoCl 2.6H 2O 1.0g; FeCl 3.6H 2O 8.0g; 加蒸馏水至100ml B 、缓冲液：
NH 4HCO 3 4.0g; NaHCO 3 35.0g; 加蒸馏水至1000ml
C 、常量元素溶液：
Na 2HPO 4.12H 2O 9.45g KH 2PO 4 6.2g
MgSO 4.7H 2O 0.6g 加蒸馏水至1000ml
D 、0.1%刃天青溶液：
100mg 刃天青溶解于 100ml 蒸馏水
E 、还原剂溶液（现用现配）：
1M NaOH 4.0ml Na 2S 9.H 2O 625mg 加蒸馏水95ml 附表2：人工唾液配制表（1000ml ）
整个过程要尽量快，特别是吸培养液和排气，最好不要超过15min
2微量元素溶液（A液）0.1 3缓冲液（B液）208.1 4常量元素溶液（C液）208.1 50.1%刃天青溶液（D液） 1.0 6还原剂溶液（E液）62.4
嘌呤法测定体外微生物蛋白产量
（一）操作流程图
（二）试剂配制及具体操作
1、试验试剂
标准曲线制备
样品处理
℃水浴4
冷却
加入
6ml 28.5mM NH 4H 2PO 4
90-95℃水浴15min
冷却
6ml 0.2M NH 4H 2PO
4
用85%–3
0.2ml 0.4M AgNO 3
5℃避光、过夜 4℃
4.5ml pH = 2 的蒸馏水冲洗
4℃90-95℃水浴30min 40.5M HCl 稀释40倍 0.5M HCl 作参比 260nm 下比色
2、测定步骤
A ．酵母RNA 标准曲线的制作:
① 分别称取5、15、25、35、45、55mg 酵母RNA 于10ml 离心管中，并加入2ml 0.6M HClO 4，于90 - 95℃水浴1小时，冷却；
② 再分别加入6ml 28.5mM NH 4H 2PO 4，于90 - 95℃水浴15min ，冷却后在3000g ，4℃条件下离心10min ；
③ 取1.6ml 上清液，向上清夜中加入6ml 0.2M NH 4H 2PO 4溶液，并用85%磷酸调整溶液pH 为2–3（一般需85%磷酸25µl）；
④ 取调整pH 值后的溶液3.8ml ，并向其中加入0.2ml 0.4M AgNO 3，混合，于5℃条件下避光、过夜；
⑤ 过夜后于3000g ，4℃条件下离心10min ，弃上清液；用4.5ml pH = 2 的蒸馏水冲洗沉淀；再于3000g ，4℃条件下离心10min ，弃上清液；
⑥ 向沉淀中加入5ml 0.5M HCl 溶液，混匀，在90 - 95℃条件下水浴30min 后，以3000g 离心10min ；
⑦ 上清液用0.5M HCl 稀释40倍后，以0.5M HCl 溶液作参比，在260nm 下比色，根据光密度值作出标准曲线。

B ．培养液中微生物蛋白质的测定:
① 取8ml 均匀发酵液于3个10ml 离心管，在20000g ，4℃条件下离心20min ；弃上清液后加入2.104ml 0.6M HClO 4，于90 – 95℃水浴1小时，冷却；
② 按照制作标准曲线的步骤②-⑥操作；
③ 以0.5M HCl 溶液作参比，在260nm 下比色，根据光密度值和标准曲线求出RNA 测定值；
④ 根据下面公式计算微生物蛋白氮产量：
其中，RNA 含氮量为17.83%，细菌氮中RNA 含氮量为10%。

浙江大学奶业科学研究所
比色法测定培养液氨态氮浓度
微生物蛋白氮（mg/ml ）=
RNA 测定值（mg/ml ）×RNA 含氮量
×稀释倍数
细菌氮中RNA 含氮量
（一）操作流程图
标准曲线制备
样品处理
8ml 0.2M HCl
摇匀、静置10min 0号管液作参比 700nm 下比色
摇匀
（二）试剂配制及具体操作
1 试验试剂
2 测定步骤
A、氨氮标准系列溶液制备
①准确称量0.382g氯化铵，用0.2M盐酸溶解，并定容到100ml，作为保存液，在冰箱
中可存放数月。

②取保存液10ml，用蒸馏水稀释定容至100ml，为工作液。

含氮量为10mg/100ml。

③取工作液0、1、2、4、6ml置于5个编号的50ml容量瓶内，接着分别加入蒸馏水10、
9、8、6、/4ml，使之都成为10ml，再用0.2M盐酸定容。

这就是每100ml中含氮量为0、
0.2、0.4、0.8、1.2mg的标准系列溶液。

B、比色与计算
①准确量取标准系列溶液0.4ml分置于5个10ml试管内，各管中再依次加入D液和E
液2ml，摇匀，静置10分钟后比色。

波长700nm，0.5cm的比色皿，用不含氮的0号管液作空白对照。

记录各消光值。

②用消光值作自变量，溶液含氮量作从变量导出回归方程式。

③样品处理：取5ml瘤胃培养液在3500-4000转/分下，离心10分钟，量取2ml上清液
（若含氮量较高，可取1ml上清液再加1ml蒸馏水），置于15ml试管内，再加入8ml 0.2M 盐酸至10ml摇匀（稀释倍数为5或10）。

比色操作同：准确量取各溶液0.4 ml 置于10ml试管内，各管内再依次加入D液和E液2ml，摇匀，静置10分钟后比色。

波长700nm，0.5cm的比色皿，用不含氮的0号管液作空白对照。

记录各消光值。

把测得的消光值代入回归公式，计算的结果乘以样品稀释的倍数就是原样中氨氮的含量。

浙江大学奶业科学研究所
柱温
体外发酵产物中挥发性脂肪酸浓度的测定
（一）操作流程图
（二）试剂配制及具体操作
1 混标制备
按表1
或表2中梯度，配制6个梯度的混合标样，用于制作标准曲线。

表1 乙酸、丙酸和丁酸混合标样的配制 （umol / ml ）
1 2 3 4 5 6 乙酸 10 20 40 80 160 320 丙酸 1 2 4 8 16 32 丁酸
1 2 4 8
16 32 表2 乙酸、丙酸和丁酸混合标样的配制 （ul / ml ）
1 2 3 4 5 6 乙酸 0.571 1.143 2.285 4.570 9.140 18.280 丙酸 0.075 0.149 0.299 0.598 1.196 2.390 丁酸
0.092
0.184
0.367
0.735
1.470
2.939
2 上机测定
HP-INNOWAX （19091N-133）毛细管柱，30m ×0.25mm ×0.25µm
200℃ 220℃
采用程序升温，80℃持续1min 后，以15℃/min 升温至170℃后维持1.5min
载气为高纯氮，压力为100kpa ，总流量63.8ml/min ，柱流量1.19ml/min ，分流比50，吹扫流量3ml/min ，循环流量30ml/min
H 2流量40ml/min ，空气流量400ml/min 2µl
样品中乙、丙、丁酸浓度测定
色谱柱
检测室温度
载气及流速
检测室气体流速 进样量
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发酵气体中甲烷含量的测定
（一）标准曲线建立
用10µl 的微量注射器分别抽取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0µl 的甲烷标准气，上机，根据甲烷的浓度和其峰面积的关系，确定甲烷的标准曲线。

由于在测定发酵气体时取样量是20µl ，故设定1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0µl 的甲烷标准气的浓度分别为5、10、15、20、25、30%。

（二）上机条件
HP-INNOWAX （19091N-133）毛细管柱，30m ×0.25mm ×0.25µm 100℃ 120℃ 80℃
载气为高纯氮，压力为179.5kpa ，总流量46.2ml/min ，柱流量2.7ml/min ，分流比15，吹扫流量3ml/min ，循环流量30ml/min
H 2流量40ml/min ，空气流量400ml/min 20µl
浙江大学奶业科学研究所
色谱柱
检测室温度 柱温 载气及流速
检测室气体流速 进样量
压力读取式体外产气法（RPT 系统）——产气瓶
（一）基础知识
体外产气法主要理念 通过体外产气装置模拟瘤胃发酵
体外产气系统组成 体外产气装置：产气瓶（相当于独立的瘤胃）、恒温培养箱（模拟瘤胃温度）；微生物培养液：1:9的瘤胃液与人工唾液；压力传感器；PC
影响实验成败的主要因素
实验过程中产气装置的温度，整个操作过程的厌氧状态、微生物活力是影响实验成败的关键
（二）操作流程图
（三）试剂配制及具体操作 1、试验前准备
称量样品 ①产气瓶编号（因为产气量的计算涉及瓶子体积，所以尽量保留原产气瓶编号，使用新瓶时要
量取瓶子体积）；②加入磁力棒；③准确称取待测样品一般约750mg （DM ，适用0.5-1.5mgDM ），置于体外产气瓶底部。

配制人工唾液 ①计算人工唾液需要量：体外培养时每个产气瓶内人工唾液的量为90ml ，瘤胃液10ml ，
依据试验设计的产气瓶数计算人工唾液和瘤胃液的需要量（预留20%，以备操作手法不当造成浪费）；②配制人工唾液中的微量元素溶液（A 液）、缓冲液（B 液）、常量元素溶液（C 液）、刃天青溶液（D 液）（可过量配制，常温下存放）和还原剂（E 液，现用现配，见附表1）。

③按附表2的顺序和比例将配制好的各原液混合后，置入水浴摇床或水浴锅内，通入CO 2气体（气流不易过大），使人工唾液由蓝色转变为粉红色，最终为无色。

分装人工唾液 不间断地将CO 2通入人工唾液瓶，用100ml 注射器或产气管吸取人工唾液90ml ，注入称有
样品的产气瓶，并用CO 2饱和（可通过三通管完成两路CO 2的同时输入）。

盖紧橡胶塞后，39±0.5℃恒温培养箱内过夜（对于青贮类等含酸较多的样品，一定要过夜，而且在正式培养前将里面所产气体排空，不计入产气量）。

微 生 39℃培养 90ml 人工唾液
10ml 瘤胃液
2、4、6、9、12h
读取瓶内气体压力 微量进样器吸取20µl 气体 测定CH 4，放气
24或48h
读取瓶内气体压力
微量进样器吸收20µl 气体
测定CH 4，放气
① ②
1ml 上清液
VFA
3个1ml 混合液
5ml 混合液 30ml 混合液
加入0.2ml 8.2%偏磷酸 4℃ 20000g 10min 4℃保存
物
NH 3-N
MCP
-80℃保存
-20
-20
其它①准备二层、四层、六层纱布各2-4块（纱布可重复使用）；②贮备两瓶热水，准备收集瓶（收集和过滤瘤胃液用）、水桶、温度计，以备次日取瘤胃液用。

2、正式试验
采集与处理瘤胃液为方便读取12h产气量，瘤胃液最好在7:30前取回。

所取瘤胃液为早饲前2h瘤胃液。

①到牧场后，将热水倒入水桶，调节水温度至39±0.5℃，用于瘤胃液保温（应时经常热水调节）；②用真空泵抽取三只湖羊的瘤胃液，混合，倒入收集瓶，盖好盖子；③回到实验室后，将收集瓶置于水浴锅内，依次用二层、四层和六层纱布过滤（应尽量快，以保持微生物的活力），获得的滤液不间断地通入CO2气体；
④将密封的产气瓶从恒温箱中取出，用6.5号针头将产气瓶中多余气体放尽；⑤用20ml注射器吸取瘤胃液10ml，通过另一16号针头注入产气瓶，将两根针头取下，产气瓶置于39±0.5℃恒温箱中培养。

空白对照和标准对照
实验过程中要有至少3个空白对照和3个标准干草对照。

空白对照不加样品只有90ml人工唾液和10ml瘤胃液，标准对照以750mg（DM）干草（优质的过80目筛的羊草）为底物，加入90ml人工唾液和10ml瘤胃液。

为了消除操作顺序和恒温培养箱条件的差异，要求空白对照和标准对照平均分布于试验前期、中期和后期，放置于培养箱的不同位置。

记录产气量培养2、4、6、9、12、24、36、48h时，如果条件允许可延长培养时间，培养粗料时，至少96h或更长（有人培养一周），用压力传感器读取产气瓶内压力（轻拿、轻放），并放气。

产气量计算
()
W
V
P
GP t
t⨯
-
⨯
=
3.
101
100
0（瓶子）
式中，GP t为样品在t时间段的产气量（ml）；P t为t时间段读取的压力（mPa）；V0为瓶子体积；101.3为标准大气压（mPa）；W为样品干物质重。

产气过程的总积累产气量为各时间段产气量之和。

瘤胃发酵样品制备①培养中途取样时，要求取样同时，向产气瓶内通入CO2，并于39℃水浴中操作; ②取混合液（发酵液及固体残渣）时要求在控温磁力搅拌机上操作。

重复试验要求体外产气试验至少培养两次，两次标准干草产气量相对偏差小于10%。

附表1：人工唾液原液配制表
A、微量元素溶液：
CaCl2.2H2O 13.2g;
MnCl2.4H2O 10.0g;
CoCl2.6H2O 1.0g;
FeCl3.6H2O 8.0g;
加蒸馏水至100ml B、缓冲液：
NH4HCO3 4.0g;
NaHCO3 35.0g;
加蒸馏水至1000ml
C、常量元素溶液：
Na2HPO4.12H2O 9.45g
KH2PO4 6.2g
MgSO4.7H2O 0.6g
加蒸馏水至1000ml D、0.1%刃天青溶液：
100mg刃天青溶解于
100ml蒸馏水
要求：使用压力传感器前，熟练软件的操作（有模拟程序可供练习）
E、还原剂溶液（现用现配）：
Cysteine HCl 625mg 蒸馏水95ml 1M NaOH 4.0ml Na2S 9.H2O 625mg
附表2：人工唾液配制表（1000ml）
顺序原液体积（ml）1蒸馏水520.2 2缓冲液（B液）208.1 3常量元素溶液（C液）208.1 4微量元素溶液（A液）0.1 50.1%刃天青溶液（D液） 1.0 6还原剂溶液（E液）62.4
瘤胃液脂肪酸测定
（一）操作流程图
85℃水浴30min
0.67ml 5M NaOH 橙指示剂
2
冷却
①加入 0.67ml 5.1M HCl ②加入
1ml 2mg/ml
C 17：0
③充满
2.5ml 氯仿/甲醇
涡旋2min 2000g 10min N 2吹干 1.0ml 正己烷悬浮 -20℃冻存
上机测定
（二）试剂配制及具体操作
1、样品处理
①. 取1ml 样品于带盖的水解管，加入0.67ml 5M NaOH 和一滴饱和甲基橙指示剂后，充满N 2； ②. 85℃水浴30min ，冷却至室温后，加入0.67ml 5.1M HCl, 使溶液pH 低于2（溶液由橙色变为红色），如果不确定，可以用pH 计检测； ③. 加入1ml 2mg/ml 的内标C 17：0；
④. 加入2.5ml 氯仿/甲醇（2: 1,v/v ）后，涡旋2min ； ⑤. 将样品在2000g 下离心10min ；
⑥. 移去上层甲醇/水层，轻轻拨开中间杂质层，将下层溶液无损失转移； ⑦. 通过含硫酸钠的干燥柱将下层氯仿滤入另一玻璃容量管； ⑧. 用氮气将样品吹干；
⑨. 用1.0ml 正己烷悬浮后，简单涡旋；
⑩. 2000 rpm 下离心10min ，样品-20℃冷冻保存。

2、上机条件
HP-INNOWAX （19091N-133）毛细管柱，30m ×0.25mm ×0.25µm
260℃ 270℃ 采用程序升
温，140℃持续5min 后，以4℃/min 升温至240℃后维持20min
载气为高纯氮，压力为100kpa ，总流量87.9ml/min ，柱流量0.84ml/min ，线
速度：25.6cm/sec ，分流比100，吹扫流量3ml/min ，循环流量30ml/min
H 2流量40ml/min ，空气流量400ml/min 产气管，2µl ；产气瓶4µl
浙江大学奶业科学研究所
色谱柱
气化室温度 检测室温度 柱温
载气及流速 检测室气体流速 进样量
Real-time PCR测定瘤胃微生物数量
一、样品采集
In vitro实验终止时，若分析混合微生物，可取1ml混合培养液于1.5ml灭菌离心管(也可直接用灭菌过的含0.3 g 0.1mm和0.1g 0.5mm锆珠的2ml 螺口管) -80度保存待用。

若要分别分析固、液相微生物时，将混合培养液过40um尼龙袋，滤液于4度500g 离心10，上清用于液体微生物DNA提取。

尼龙袋于39度灭菌水中冲洗至澄清用吸水纸吸干水份，-80度保存用于固相微生物DNA的提取。

In Sacco方法与此相似。

二、总DNA的提取
1 试验材料：1.5 mL EP管、螺口管、锆珠、1 mL、 200uL、20ul枪头（均需灭菌）、涡旋器、高速离心机等。

2 所需试剂：NaOH、Tris碱、EDTA二钠、NaCl、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、冷乙醇。

3.溶液配制方法：
试剂方法
A10 M NaOH称取40 g NaOH，加到100 mL水中。

无需除菌。

B 5 M NaCl称取29.22 g NaCl，加水溶解定容至100mL。

C 1 M，pH 8.0 Tris-HCl称取12.114 g Tris碱，加80 mL水，用浓盐酸调pH至
8.0，加水定容至100 mL。

D0.5 M，pH 8.0 EDTA将18.61 g EDTA-Na.加入80 mL水中，在磁力搅拌器上
剧烈搅拌。

用10 N的NaOH调节溶液的pH值至8.0，加
水定容至100 mL。

E TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，
1 mM EDTA，
pH 8.0）吸取1 mL 1M的Tris-HCl和0.2 mL 0.5 M的EDTA，加水定容至100 mL。

F TN150(10 mM Tris-HCl;
150 mM NaCl，pH 8.0)
1ml 1M的Tris-HCl和3ml 5M NaCl, 加水定容至100ml。

G Tris 饱和酚 (pH8.0)购买
H24：1的氯仿∕异戊醇240 mL氯仿+10mL异戊醇
I无水乙醇-20度保存。

J70%乙醇70 mL无水乙醇加30 mL水-20度保存。

⑴液相微生物：冰上解冻样品后于4度20000g离心5min，弃上清液。

加入1 mL TN150悬
浮沉淀，再加150 µL的Tris饱和酚，Bead-beater匀浆（4600g，2min），冰上两分钟冷却，重复三次。

固相微生物：称取0.35g 固体培养物于2ml螺口管，再称0.3g 0.1mm和0.1g 0.5mm灭
菌过的锆珠。

加入1 mL TN150，150
µL的Tris饱和酚，Bead-beater匀浆（4600g，2min），冰上冷却两分钟，重复三次。

以下步骤相同
(2)加入150µL氯仿∕异戊醇，涡旋混匀。

20000g离心5 min，上清液转至已1.5 mL EP管中。

(3)加入150 µL氯仿∕异戊醇和150 µL Tris饱和酚，涡旋混匀1 min，10000g 离心1min，
上清液转至1.5 mL EP管中。

(4)重复上述步骤直至水相和有机相之间的界面清晰为止(一般需3-5次)。

上清液转至1.5
mL EP管中。

(5) 加入300 µL氯仿∕异戊醇，涡旋混匀1 min。

10000g 离心1min，准确量取上清液转至
1.5 mL EP管中。

(6) 加入2倍上清体积的冷无水乙醇及1/10倍上清体积的5 M NaCl，涡旋混匀，-20 ºC 沉淀DNA 2小时（或> 30min以上）。

10000g 离心10 min，弃上清。

(7) 加入500 µL 70％冷乙醇洗涤沉淀，10000g 离心5 min，弃上清，重复三次，风干沉淀。

(8) 加入50 -100 µL TE缓冲液溶解DNA。

提取的DNA部分用于紫外分光光度计测OD值，其余-20 ºC保存。

(9) DNA质量检测：紫外分光光度计测OD值
浓度计算：DNA（ng∕ul）＝OD260×50×稀释倍数
纯度：OD260∕OD280为1.8 -2.0，若低于此值，则可能有蛋白污染。

完整性：取5 µL+1uL上样缓冲液作0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测 (DNA与上样缓冲液比例为5：1) 。

三、Real-time PCR操作步骤(ABI7500)：
1. 稀释DNA模板至0.5或1 ng/ul。

2. 按所测微生物种类及样品数量计算出所需试剂量：(由于我们现阶段用的还是相对于总菌的定量，每一样品所测菌都要求对应一个总菌，所以同一样品最好在同一块板上同时测出所有菌，一方面可以减少试剂用量，另一方面也可以减少板与板之间的差异。

每一样品设三个复孔)。

举例：测包括总菌在内的5种菌时，一个96孔板可以测的样品数为：3复孔*5种菌*6个样+5种菌阴性对照=95孔，或3复孔*6种菌*5个样+6种菌阴性对照=96孔，最大限度地利用96孔板)。

以TaKaRa (DRR041A) SYBR Premix Ex Taq试剂盒为例：
分装完之后，小心撕开real-time PCR 专用光学透明膜覆盖于96孔板上，用刮板将膜刮紧密封在96孔板上，以防液体蒸发。

稍作离心。

3.反应程序 按如下程序进行：
四、ABI 7500型荧光定量PCR 仪操作指南 1. 开机
(1). 确认电脑与主机的数据通讯线(灰色USB 连线)连接正确。

(2). 确认电脑处于外接电源供电状态。

(3). 启动电脑，进入Windows 操作系统。

(4). 待桌面图标出现后，打开ABI7500主机的电源。

(5). 待主机的电源指示灯点亮后，启动7500 System Software应用软件。

2. 实时定量的软件运行
(1). 新建文件菜单Create new Document，Assay选择Absolute Quantification (实时定量模式)，下一步
(2).选择add detector,或者添加已有的detector到右边栏，完成，打开一个空白的96孔板文件。

.选择命名孔，双击或右击鼠标，打开Well Inspector窗口。

(3)..首次使用软件，或者探针（Detector）没有设置好，请点击Add Detector按钮，打开Detector Manager窗口。

如果Detector列表中没有合适的探针，点击按钮File → New，新建探针：设定探针的名称(建议使用所研究基因符号加标记荧光，如GAPDH_FAM、ACTIN_VIC 等)、报告基团(FAM或者VIC)、淬灭基团(TaqMan探针选TAMRA；MGB探针选None)、颜色(任意指定)等。

设置完成后点击OK，该探针即出现在探针列表中。

重复此过程，设立其他的探针。

(4). 在Detector Manager窗口，从探针列表中点击选择所需探针，按住Ctrl键可以选择多个探针，再点击Add to Plate Document按钮。

最后点击Done关闭Detector Manager窗口。

此时Well Inspector窗口仍然是打开的。

(5). 填样品表在96孔表中选定有样品的一个或多个孔，在Well Inspector页面的Sample Name栏中填入样品名称；在探针列表的Use项下的方框中，打钩选择要用的一个或多个探针；在Task栏中选择指定样品类领：阴性对照选NTC；未知样品选Unknown；标准品选Standard。

对于Standard，还要在Quantity栏中输入DNA拷贝数。

注意：只有在这里输入拷贝数后，软件才能自动生成标准曲线。

建议标准品的浓度在5点以上。

建议每个样品(包括标准品)都按照统计学要求作一定数量的复管。

(6). 参比荧光 (Passive Reference)选ROX；如果使用的试剂中不含有参比荧光，请选None。

完成后点击右上角的X按钮，关闭Well Inspector窗口。

(7). 循环参数切换到Instrument页面，设定及修改PCR热循环程序：在ABI公司默认的程序中，50°C 2 min是UNG酶起作用的步骤，UNG酶可以预防PCR产物(其中以U代替T)对定量PCR 的污染；95°C 10 min的作用是激活金牌Taq酶，同时灭活UNG酶；40个循环的95°C 15 sec 和60°C 1 min是定量PCR的循环步骤。

7000默认在最后一步，也就是60°C 1 min复性和延伸时收集荧光信号。

如果使用ABI公司的定量PCR试剂，上述参数不需要调整，直接运行PCR 循环就可以了。

在使用其他厂家试剂的情况下，如果其中没有UNG酶，请删除50°C 2 min 步骤；如果使用的不是金牌Taq酶而是其他普通的Taq酶，请删除95°C 10 min步骤。

如用的是TaKaRa试剂盒，删除50°C 2 min步骤，95°C 10 min改为95°C 5秒。

(8). 循环参数的修改方法删除：按住Shift键并在相应的Stage或Step中点击，使该步骤被选中变黑，再按Del键即可删除。

插入：在需要插入参数的位置点击，出现粗黑竖线后，分别点击
Add Hold、Add Cycle或Add Step按钮添加保温、循环或循环中的一个步骤。

修改温度和时间：拖动鼠标，选中需要修改的温度或时间数字，输入新的数值即可。

(9). 其他设置：
反应体积：定量PCR的标准反应体积是50 µL；使用96孔板可以用20uL，依所用试剂而定。

融解曲线试验：点击Add Dissociation Stage，仪器即在定量PCR循环完成后继续做融解曲线试验。

如果是采用SYBR Green I染料方法进行定量研究，建议进行融解曲线试验，以判定PCR反应特异与否。

单峰表示单一的PCR扩增产物，多峰表示PCR扩增有杂带。

注意：只有SYBR Green I染料方法才需要进行融解曲线试验，TaqMan探针和MGB探针法都不需要。

(10). Save按钮保存文件设置。

确认96孔板或全部样品管在主机内放置妥当后，点击Start 按钮，开始PCR循环。

屏幕上动态显示PCR进程和剩余时间。

(11). 监控进程切换到Results页面的Amp Plot子页面，可以实时显示PCR曲线随着循环增加而逐步增长的实际情况。

可在Detector中选相应的目标观察。

如果选All，则同时显示所有探针的反应进程。

(12). 程序结束后，点击Analysis Settings中的Auto Ct,再点菜单上方向或的绿色箭头分析结果，保存结果(可以保存为.sds格式，也可以保存为.sdt格式，作为以后同类实验的模板，节省软件设置时间)。

退出程序，关闭ABI7500主机电源。

3. 实时定量的数据分析
(1). 数据分析切换到Result页面，进入扩增曲线(Amplification Plot)子页面，查看软件已经自动分析好的实验结果。

注意：此时的数据是软件根据默认值（基线起点为3，终点为15）得到的初步结果，还需要根据本次实验的具体情况，精细调节Baseline（基线）的起止点后，重新分析，以得到更精确的数据。

(2). 基线的起点和终点确定原则基线(Baseline)是指PCR开始时信号很低、接近背景且比较平稳的那个阶段。

起点要避开开始几个循环由于高温导致的信号增高，设在信号已经降到背景高度且能维持平稳的地方，一般在3到6个循环之间；终点要避免覆盖信号已经开始有明显增长的地方，一般在本组数据中最小的CT值前再3个循环处。

另外，起点与终点之间最好能间隔8个循环以上，以满足统计基线标准偏差的数学要求。

调整好起止点以后，再点击Analyze 按钮，软件即自动计算新的阈值和CT值，并更新实验报告。

注意：此时扩增曲线页面上显示的阈值数字并不更新，但是这不影响后台数据运算的准确。

(3). 线性图谱在默认的设置中，PCR扩增曲线图谱的纵坐标代表经过ROX和空白校正后的相对荧光信号强度，横坐标代表PCR循环次数（从1到40）；纵坐标以对数表示，横坐标以线性表示。

如果要看完全线性的S形图谱，请双击纵坐标轴线，打开坐标设置窗口，将纵坐标改成线性形式。

(4). 原始数据切换到Component子页面，察看原始数据。

正常的SYBR信号强度，中间呈S形增长；ROX信号是水平稳定的，不随PCR进程而改变，因为ROX是以固定浓度加入到PCR试剂中。