细胞因子检测方法 ppt课件

所需仪器
流式细胞仪
所需试剂
１．细胞表面染色的荧光标记的单抗试剂 ２．荧光标记的细胞因子抗体 ３．激活剂： ① Phorbol 12-Myristate 13 Acetate (PMA) ② Ionomycin ③ Staphylococcal enterotoxin B(SEB) ４．蛋白转运抑制剂：阻断高尔基体介导的转运作用，使
夹心ELISA
缺点：不能显示出单个细胞产生细胞因子的同 一性和频率性的直接信息
细胞内细胞因子的免疫荧光检测 ELISPOT 原位杂交 单一细胞PCR
细胞内细胞因子的流式细胞仪检测
原理：Brefeldin(BFA)、Monensin阻断了胞内 高尔基体介导的转运方法，使得细胞因子聚集、 蓄积，增强细胞因子信号，可被流式细胞仪检 测。
分子生物学法只能检测基因表达情况，不能直接提供 有关因子的浓度及活性等资料，主要用于机制探讨。
影响因素
原理与方法 灵敏度 准确度和特异性 精密度 ：免疫分析法的精密度较其生物分析
法有较大提高 ；批内变异通常为20%～25%， 因此有必要进行2次或3次检测 标准化
生物分析法和免疫分析法结合使用
小结
生物学检测法比较敏感，又可直接测定生物学功能， 是最可靠的方法，适用于各种实验目的，是科研部门 最常用的技术，但需要长期培养依赖性细胞株，检测 耗时长，步骤繁杂，影响因素多，不容易熟练掌握。
免疫学检测法比较简单，迅速，重复性好，但所测定 的只代表相应细胞因子的量而不代表活性，同时敏感 度也低于生物活性检测法（约低10～100倍）。
第2步，加入酶标的抗体，结合被捕获的细胞 因子
第3步，加入酶的底物显色，酶标仪或者化学 发光议读取结果（OD：optical density）
第4步，绘制标准曲线，计算标本中细胞因子 的含量
注意事项
实验前： 确定试剂盒在有效期内 仔细阅读说明书 按说明书确定所有试剂齐全（数量、体积） 根据检测标本数量确定所需试剂的量 按说明书将所用试剂平衡至室温，配制所需试剂
用途：检测单个细胞内多个细胞因子；并可区 分表达特定细胞因子的细胞亚群。
细胞内细胞因子的流式细胞仪检测
方法：用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志 组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用 特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞 的最小荧光背景。
特点： 快速
简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMCs； 灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统； 高效：在同一细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也 可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞亚群； 接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境 更准确反映了体内状况。
得刺激细胞表达的细胞因子聚集在胞浆内质网内，以利于 准确检测细胞产生细胞因子的能力 ① Brefeldin-A(BFA)：10mg/ml．在激活过程最后4-5小时使 用BFA ，过度孵育会导致细胞活力下降 ② Monensin：3uM
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（二）功能检测
利用一些细胞因子的功能特性，可建立相应的 活性测定方法，如干扰素的抑制病毒感染效应， 肿瘤坏死因子对L929细胞的杀伤作用等。这样 的方法敏感性高，但特异性不够，容易受一些 扰因素的影响。
免疫分析法
（1）放免实验（RIA） （2）酶联免疫吸附实验（ELISA）
mRNA的测定
（1）分子杂交实验 （2）逆转录PCR（RT-PCR）
注意事项
标本的制备和贮存 ： 血清、血浆标本 ：尽快分装 ，贮存在-70℃ ，
避免反复冻融 。使用前将标本平衡至室温， 不能用水浴锅 细胞培养上清液：1500g离心10～15分钟去除 细胞和细胞残渣。
注意事项
试剂盒贮存条件和有效期 未开封试剂盒：贮存在2-8℃ 开封/复溶试剂 ：2-8℃可以1个月左右 标准品：分装并贮存在-20℃以下，1个月，避
3． 竞争ELISA（Competitive ELISA）用于确定抗原 特异性或待检标本中含交叉反应成分时为了提高实验 的特异性而使用的一种方法。根据标记抗原与同种未 标记待测抗原与抗体间发生竞争性结合的原理，主要 用于测定小分子抗原。
夹心ELISA
第1步，包被捕获抗体到96孔板中，BSA阻断 后加入标准品或者标本
免疫分析法
ELISA 细胞内细胞因子的流式细胞仪检测 ELISPOT
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
1． 间接ELISA（Indirect ELISA）：用于筛检抗体 （抗特定抗原成分的特异性抗体）。此法是测定抗体 最常用的方法。
2． 夹心ELISA（Sandwich ELISA）：用于检测目的 抗原的量。其优点是避免了对特异性抗体的直接标记， 但增加了操作步骤和测定时间。
细胞因子检测方法
背景
细胞因子检测是判断机体免疫功能的一个重要 指标
疾病的诊断、病程观察、疗效判断及细胞因子 治疗监测等
（一）依赖性细胞株 ：生物分析法 （二）功能检测 ：生物分析法 （三）免疫测定 ：免疫分析法 （四）功能测定与抗体抑制 （五）分子杂交技术 ：mRNA的测定 （六）多聚酶链反应技术（PCR）：mRNA的
测定
生物分析法
（一）依赖性细胞株
一些肿瘤细胞株必须依赖于细胞因子方能 在体外增殖，如DTLL细胞株依赖IL-2；FDCPL细胞株依赖于小鼠IL-3；TF-1细胞株依赖于 人IL-3和人GM-CSF，因而可利用这些依赖细 胞株检测相应的细胞因子。这种方法敏感性高， 特异性也不错，但可异的是并非所有细胞因都 能找到相应的细胞株，因而限制了它的应用。
免反复冻融 微孔板：将未使用的板条用箔纸包好，加上干
燥剂沿四周封口。2-8℃可以1个月左右
检测方法的进展
高通量细胞因子检测
CBA(Cytometric Bead Array)是一种微珠多 用途检测分析技术，它由一系列的微珠组合来 捕获并结合流式细胞仪技术检测细胞培养液、 EDTA血浆、血清样本中被检测物质的量。其 采用夹心法分析策略，与传统的ELISA分析技 术相比，此方法可以同时检测多项指标。用已 知的标准品和对照标准曲线就可以得出被测样 本的浓度。此分析方法不受样本量的限制，而 且可以得到一个样本的多个数据。