PCR技术的原理与方法
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蛋白酶K 能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的 组蛋白, 再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和 其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸
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15
MG2+浓度
Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影 响
在一般的 PCR反应中，各种NTP浓度为 200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜
7
PCR的反应体系
10×扩增缓冲液
1/10体积
4种dNTP混合物
各200umol/L
引物 (2个)
0.2umol/L
模板DNA
102 ～ 105
Taq DNA聚合酶 1 ～ 2.5单位/反应体系
Mg2+
1.5～2.5mmol/L
加双或三蒸水至
25 ～ 50ul
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8
PCR反应五要素
引物（primer） 酶 （Taq DNA polymerase） dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 模板 （template） Mg2+ （magnesium）
对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，
55℃为选择最适退火温度的起点较为理想
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20
延伸温度与时间
延伸温度：一般选择在70～75℃之间 常用温度为72℃ 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
近72℃ 引物3′端要避开密码子的第3位 引物3′端不能选择A，最好选择T 碱基要随机分布 引物自身及引物之间不应存在互补序列
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11
引物设计的原则
引物5′ 端和中间△G值应该相对较高， 而3′ 端△G值较低
引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰 扩增产物的单链不能形成二级结构 引物应具有特异性
PCR技术的原理与方法
钟召迪
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1
PCR定义
聚 合 酶 链 反 应 (Polymerase Chain Reaction)简称ＰＣＲ，是一项在短时间内 大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学 技术。
是指在DNA 聚合酶的催化下，以母链DNA 为模板，一特定引物为延伸起点，经过变 性、退火、延伸等步骤，体外复制出于母 链模板DNA互补的子链DNA的过程。
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12
酶及其浓度
目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应
天然酶：从栖热水生杆菌中提纯 基因工程酶：大肠菌合成
一个典型的 PCR反应约需酶量 2.5U（指 总反应体积为100 ul时）
浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低 则合成产物量减少
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13
DNTP 的质量与浓度
dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系 dNTP呈颗粒状， 保存不当易变性失活 dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后， 以1M NaOH或1M Tris-HCl的缓冲液将其pH 调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保 存。多次冻融会使dNTP降解 在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤 其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配 制 ）， 如其中任何一种浓度不同于其它 几种时（偏高或偏低），就会引起错配。 浓度过低又会降低PCR产物的产量 dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低
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9
引物
引物是PCR特异性反应的关键 PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA
互补的程度 理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，
就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物， 用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增
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10
引物设计的原则
引物最好在模板cDNA的保守区内设计 引物长度一般在15~30碱基之间 引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接
Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非 特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA聚合 酶的活性，使反应产物减少
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16
PCR反应条件的选择
PCR反应条件:
温度 时间 循环次数
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17
温度与时间的设置
设置变性-退火-延伸三个温度点
标准反应中采用三温度点法，双链DNA在 90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃， 引物退火并结合到靶序列上，然后快速升 温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用 下，使引物链沿模板延伸
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5
PCR的反应基本步骤
PCR的反应基本步骤 变性：高温使双链DNA解离成单链（94
℃ ，30s） 退火：低温下，引物与DNA模板互补区结
合（55 ℃ ， 30s ） 延伸：中温延伸，DNA聚合酶催化以引物
为起点的DNA链延伸反应（70~72 ℃ ， 30~60s）
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6
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可用于基因分离克隆，序列分析，基因 表达调控，基因多态性研究等。
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2
PCR反应特点
特异性强 灵敏度高 简便、快速 对标本的纯度要求低
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3
PCR技术的基本原理
PCR的反应成分 PCR的反应基本步骤 PCR的反应体系
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4
PCR的反应成分
模板DNA 引物 四种脱氧核糖核苷酸 DNA聚合酶 反应缓冲液，Mg2
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14
模板（靶基因，TARGET GENE）
模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与 否的关键环节之一
传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶 K 来消化Βιβλιοθήκη Baidu理标本
SDS 的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质， 因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的 核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀
对于较短靶基因（长度为100～300bp时） 可采用二温度点法， 将退火与延伸温度合 二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退 火与延伸
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18
变性温度与时间
变性温度低，解链不完全是导致PCR失败 的最主要原因
一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性
若低于93℃则需延长时间
但温度不能过高，因为高温环境对酶的 活性有影响。
此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全
变性，就会导致PCR失败
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19
退火(复性)温度与时间
退火温度是影响PCR特异性的较重要因素
变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使 引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引 物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合 机会远远高于模板互补链之间的碰撞
退火温度与时间，取决于引物的长度、碱 基组成及其浓度，还有靶基序列的长度
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MG2+浓度
Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影 响
在一般的 PCR反应中，各种NTP浓度为 200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜
7
PCR的反应体系
10×扩增缓冲液
1/10体积
4种dNTP混合物
各200umol/L
引物 (2个)
0.2umol/L
模板DNA
102 ～ 105
Taq DNA聚合酶 1 ～ 2.5单位/反应体系
Mg2+
1.5～2.5mmol/L
加双或三蒸水至
25 ～ 50ul
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8
PCR反应五要素
引物（primer） 酶 （Taq DNA polymerase） dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 模板 （template） Mg2+ （magnesium）
对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，
55℃为选择最适退火温度的起点较为理想
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延伸温度与时间
延伸温度：一般选择在70～75℃之间 常用温度为72℃ 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
近72℃ 引物3′端要避开密码子的第3位 引物3′端不能选择A，最好选择T 碱基要随机分布 引物自身及引物之间不应存在互补序列
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引物设计的原则
引物5′ 端和中间△G值应该相对较高， 而3′ 端△G值较低
引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰 扩增产物的单链不能形成二级结构 引物应具有特异性
PCR技术的原理与方法
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PCR定义
聚 合 酶 链 反 应 (Polymerase Chain Reaction)简称ＰＣＲ，是一项在短时间内 大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学 技术。
是指在DNA 聚合酶的催化下，以母链DNA 为模板，一特定引物为延伸起点，经过变 性、退火、延伸等步骤，体外复制出于母 链模板DNA互补的子链DNA的过程。
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酶及其浓度
目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应
天然酶：从栖热水生杆菌中提纯 基因工程酶：大肠菌合成
一个典型的 PCR反应约需酶量 2.5U（指 总反应体积为100 ul时）
浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低 则合成产物量减少
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DNTP 的质量与浓度
dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系 dNTP呈颗粒状， 保存不当易变性失活 dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后， 以1M NaOH或1M Tris-HCl的缓冲液将其pH 调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保 存。多次冻融会使dNTP降解 在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤 其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配 制 ）， 如其中任何一种浓度不同于其它 几种时（偏高或偏低），就会引起错配。 浓度过低又会降低PCR产物的产量 dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低
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引物
引物是PCR特异性反应的关键 PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA
互补的程度 理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，
就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物， 用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增
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引物设计的原则
引物最好在模板cDNA的保守区内设计 引物长度一般在15~30碱基之间 引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接
Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非 特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA聚合 酶的活性，使反应产物减少
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PCR反应条件的选择
PCR反应条件:
温度 时间 循环次数
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温度与时间的设置
设置变性-退火-延伸三个温度点
标准反应中采用三温度点法，双链DNA在 90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃， 引物退火并结合到靶序列上，然后快速升 温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用 下，使引物链沿模板延伸
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PCR的反应基本步骤
PCR的反应基本步骤 变性：高温使双链DNA解离成单链（94
℃ ，30s） 退火：低温下，引物与DNA模板互补区结
合（55 ℃ ， 30s ） 延伸：中温延伸，DNA聚合酶催化以引物
为起点的DNA链延伸反应（70~72 ℃ ， 30~60s）
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PCR反应特点
特异性强 灵敏度高 简便、快速 对标本的纯度要求低
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PCR技术的基本原理
PCR的反应成分 PCR的反应基本步骤 PCR的反应体系
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PCR的反应成分
模板DNA 引物 四种脱氧核糖核苷酸 DNA聚合酶 反应缓冲液，Mg2
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模板（靶基因，TARGET GENE）
模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与 否的关键环节之一
传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶 K 来消化Βιβλιοθήκη Baidu理标本
SDS 的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质， 因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的 核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀
对于较短靶基因（长度为100～300bp时） 可采用二温度点法， 将退火与延伸温度合 二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退 火与延伸
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变性温度与时间
变性温度低，解链不完全是导致PCR失败 的最主要原因
一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性
若低于93℃则需延长时间
但温度不能过高，因为高温环境对酶的 活性有影响。
此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全
变性，就会导致PCR失败
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退火(复性)温度与时间
退火温度是影响PCR特异性的较重要因素
变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使 引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引 物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合 机会远远高于模板互补链之间的碰撞
退火温度与时间，取决于引物的长度、碱 基组成及其浓度，还有靶基序列的长度