基因载体的选择与构建

（2）不相容性
同一复制系统的不同质粒在同一细菌中 不能相容 不同复制系统的质粒在同一细菌中可共存
（3）可扩增性
质粒就其复制方式而言分为两类
松弛型复制 严谨型复制
（4）可转移性
在天然条件下，大多质粒可通过 细菌接合作用从一种宿主细胞内转移 到另外一种宿主内。
2、质粒的构建
（1） 天然存在的两种质粒
DNA
3）连接样品DNA和质粒DNA的消 化产物
冷循环器
4）用连接产物转化大肠杆菌感 受态细胞
转化细菌有两个基本方法。 一是 化学法，即用CaCl 2 处理并加热激以
促进DNA进入菌体； 二是电激法，即 施加短脉冲的电荷以促进
DNA 吸收。
5）细菌在加有Amp+X-Gal 的培养 基上生长以进行筛选
2） λ基因组非常大，对于每一种酶来讲都含 有超过 1个的识别序列，酶切后产生多个片段， 连接不能形成 λ基因组。
4、典型的质粒克隆技术
1) 用限制性内切酶消化 DNA 样品 2)用限制性内切酶消化 质粒DNA 3) 连接样品DNA和质粒DNA的消化产物 4) 用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 5) 涂布在琼脂平板上进行耐抗菌素筛选
1）用限制性酶消化 DNA 样品
粘性末端
2） 用 限 制 性 内 切 酶 消 化 质 粒
二）载体应具备的特征条件
1.能在宿主细胞内独立和稳定的自我复制 2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或 整合位点 3.长度尽可能小，以提高其载装能力 4.具有多种单一的酶切位点 5.具有合适的选择性标记
多克隆位点
polylinker
复制起始点 ori
Amp遗传标记
基因载体
三）质 粒 （plasmid ）
Amp r
Tc
1)限制酶切
2)DNA重组
利
无DNA插入
有DNA插入
用 抗
Amp r Tc r
转化
外源DNA
Amp r Tc s
性 基
Amp r Tc r
Amp r Tc s
因 进
行
无菌落
筛选重组子
阳性菌落
重
组
子
的
提取DNA 电泳
筛
选
Amp r Tc s
重组DNA
3、质粒的制备
实验室一般使用两种方法制备质粒
噬菌体通过特殊的生物学方式感染宿主细 胞，将其 DNA导入 ： （1）吸附
（2）DNA注入 （3）DNA复制 （4）包装: 只能包装 λ-DNA分子的75%-105%
即包装范围为 36.4kb-50.9kb 的DNA （5）裂解
吸附 成熟、释放
穿入 生物合成
毒性噬菌体的溶菌性周期
温和噬菌体的溶菌性周期
质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体 而自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子 （Covalently closed Circular DNA, ccc DNA）。 ★不是细菌生长所必需的 ★可赋予细菌抵御外界因素不利影响的能力 ★分子量在1-200kb之间
1、质粒的基本特性
（1）自主复制性
携带有自己的复制起始区（ ori ） 控制质粒拷贝数的基因 能独立于宿主细胞的染色体 DNA而自主复制
（d）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷 贝为多拷贝
（e）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基 因元件
例如：pBR322
pBR322 为4.36kb 的环状双链 DNA。
普通型载体pBR322 的结构图
PstI
ScaI
Ampr
HindIII BamHI
SalI
pBR322
(4.36 kb)
ori
第三章 基因载体的选择与构建
一、载体的功能、特征及质粒载体
克隆载体（ clony vector ）：具有在细胞内进行 自我复制的 DNA分子，起运送目的基因到受体 细胞的作用。
目前基因工程中常用的载体有： 细菌质粒、噬菌体载体、黏粒载体、
病毒载体、人工染色体等。
一）载体的功能 1.运送外源基因高效转入受体细胞 2.为外源基因提供复制能力或整合能力 3.为外源基因的扩增或表达提供条件
（1） 碱裂解法 （2） 沸水浴法
（1）碱裂解法
原理：利用溶菌酶在 NaOH 与SDS的混合溶液中破坏 细菌外壁，去除染色体 DNA及变性蛋白质， 离心，苯
酚－氯仿溶液处理，乙醇或异丙醇沉淀水相质粒。
特点：质粒较纯，收得率高，繁琐，且 有开环现象
（2） 沸水浴法
特点：质粒不纯，收得率低，且制备规模小， 但快速，特别适用于重组质粒的鉴定。
前噬菌体
温和噬菌体的溶源性周期
源自文库
二） λ－DNA载体的构建
λ 噬菌体线性双链 DNA病毒，具有末端互补的 12nt， 感染细菌后粘端互补成双链环状。全长 48 531bp ，含 50多个基因。
建立λ克隆载体前需要解决两个问题：
1） λDNA分子只能增加 5% 的大小，即只能插 入3kb 的DNA分子。
A、colE1 宿主细菌大肠杆菌 6.5kb 松弛型复制 20-30/cell
B、pSC101 宿主细菌沙门氏菌 8.8kb 严谨型复 制5copy/cell
（2） 质粒人工构建的目的
天然质粒存在缺陷 不适合用作基因工程的载体 必须对之进行改造构建
方法:重组，“拼拼接接，挖肉补疮 ”
（a）加入合适的选择标记基因 （b）增加或减少合适的酶切位点 （c）缩短长度，增加装载量
X-gal
X-gal水解
筛选结果
? 蓝菌落代表含有质粒的耐药菌，表
达出由完好的α LacZ序列编码的功能 性的 α 片段
? 白菌落代表含有质粒的耐氨苄青霉
素菌，质粒上α LacZ序列上有插入片 段
筛选结果模式图
蓝 菌 落
蓝白菌落
筛选白色菌落
二、噬菌体载体与黏粒载体
一）噬菌体载体
λ噬菌体是大 肠杆菌的噬菌体， 它由外壳蛋白和 λ-DNA组成
噬菌体 (电镜图）
1、λ-DNA的物理图谱
λ-DNA 为线状双链 DNA 分子，两端各有一个 12核苷 酸的互补单链（粘性末端） GGGCGGCGAC CT, CCCGCCGCTGGA ，称为 cos区，全长48.5kb 。
特点是功能相近的基因在基 因组中聚集在一起。
cos
位 点 的 作 用
2、感染周期
筛选会有三种结果：
一是要插入的序列自连，结果没有 菌落形成；
二是切开的质粒重连，结果表现为 蓝色菌落；
三是要插入的序列与质粒相连，产 生白色的抗氨苄青霉素菌落。
Amp+X-Gal+IPTG 培养基的筛选菌落法
倒平板
加IPTG和X-GAL
乳糖和诱导物IPTG的化学结构
iso propyl-beta-Dthio galactopyranoside