微生物鉴定中常用的生理生化实验

微生物鉴定中常用的生理生化实验
摘要：大分子物质水解试验中，将所要检测的菌种（枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌）接种到淀粉培养基和油脂培养基上，培养一段时间后在淀粉培养基滴上碘液，通过比较透明圈来判断各微生物水解淀粉能力的强弱；观察油脂培养基上是否有红斑点产生来判断微生物是产生脂肪酶。

糖发酵试验中向葡萄糖发酵培养基试管和乳糖培养基试管中各接种大肠杆菌和变形杆菌，并留一空白培养基试管对照。

经过一段时间培养后对试管中的颜色变化和产气情况进行观察。

IMVIC 试验中向蛋白胨培养基和葡萄糖蛋白胨水培养基中各接种上大肠杆菌和产
气杆菌，经过一段时间培养后，向葡萄糖培养基的培养物中滴上甲基红试剂，通过颜色变化来判断微生物生长代谢产物中是否有有机酸产生；向蛋白胨培养基中先加入适量的乙醚后再沿壁加入对二甲基氨基苯甲醛试剂，根据产生红色反应层与否来判断微生物生长代谢中是否有产生吲哚，进而来判断微生物对色氨酸是否有分解能力。

关键词接种无菌操作
前言微生物必须依靠包外酶对大分子物质进行水解后才能被其加以利用，这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。

淀粉遇碘液时显蓝色，当滴有碘液后不显蓝色则说明细菌产生了淀粉酶；脂肪水解后会产生脂肪酸降低培养基的PH值，使培养基中含有的中性红试剂由淡红色转变为深红色，说明细胞外存在脂肪酶。

绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异，有些细菌能分解某种糖产生的有机酸和气体，有些细菌只产酸不产气。

大肠杆菌能分解葡萄糖和乳糖并产酸产气；变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。

当发酵产酸时，培养基试管中的培养液会由紫色转变为黄色，当产气时，试管中的倒置德汉氏小管中会有气泡。

有些细菌能产生分解蛋白胨中色氨酸的色氨酸酶，分解产生吲哚和丙酮酸。

吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。

在细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变使加入培养基中的甲基红指示剂变红。

在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢。

代谢过程主要是酶促返反应过程。

具有酶功能的蛋白质多数在细胞内。

许多细菌产生包外酶，这些酶从细胞中释放出来，以催化细胞外的化学反应。

各种微生物在代谢类型上表现出很大的差异性，反应除出它们具有不同的酶系和不同的生理特性，这些特性可被作为细菌鉴定和分类的内容。

材料与方法
1.1材料
1.1.1培养基
淀粉培养基：蛋白胨10g、NaCl5g、牛肉膏5g、可溶性淀粉2g、蒸馏水1000ml、琼脂15-20g。

油脂培养基：蛋白胨10g、牛肉膏5g、NaCl5g、香油或花生油10g、1.6%中性红水溶液1ml、琼脂15-20g、蒸馏水1000ml、PH 7.2。

蛋白胨水培养基：蛋白胨10g、NaCl5g、蒸馏水1000ml、PH 7.6。

糖发酵培养基：蛋白胨水培养基1000ml、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1-2ml、PH 7.6、20%葡萄糖溶液10ml（葡萄糖发酵培养基）、20%乳糖溶液10ml（乳糖发酵培养基）。

葡糖糖蛋白胨水培养基：蛋白胨5g、葡萄糖5g、K2HPO42g、蒸馏水1000ml、PH 7.0-7.2。

1.1.2标准菌株
酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、产气大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡糖球菌、变形杆菌
1.1.2仪器及其他用品
酒精灯接种环碘液乙醚吲哚甲基红对二甲基氨基苯甲醛培养皿试管德汉氏小管胶头滴管
1.2方法
1.2.1大分子物质的水解实验(铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、
金黄色葡萄球菌)
1.2.1.1淀粉水解实验
1）配好培养基后灭菌，在无菌条件下制成平板并冷却。

2）用记号笔在平板底部化成四个区域，并标记好每个区域将要接种的菌种名称。

3）将铜绿假单胞杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌在无菌操作下点种到所对应的标记区域内，接种3个平板。

4）将平板倒置在37℃的培养箱中培养24h。

5）观察各菌种的生长情况，打开平板盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均与铺满整个平板，观察菌苔周围出现无色透明圈。

1.2.1.2油脂水解实验
1）配好培养基后灭菌，在无菌条件下制成平板并冷却。

2）用记号笔在平板底部化成四个区域，并标记好每个区域将要接种的菌种名称。

3）将铜绿假单胞杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌在无菌操作下分别画十字线接种到所对应的标记区域内，接种3个平板。

4）将平板倒置在37℃的培养箱中培养24h。

5）取出平板，观察菌苔颜色，看是否出现红色斑点。

1.2.2糖发酵试验（大肠杆菌、产气大肠杆菌）
注意：在将培养基装入试管时要先用胶头滴管将德汉氏小管注满培养基，再小心倒置在试管中，以防空气进入其中。

1）将配置好并标明培养基名称的发酵培养基灭过菌后冷却到一定的温度。

2）用记号笔在个试管壁上标明发酵培养基将要接种的菌种名称。

3）取葡萄糖发酵培养基试管5只，分别按其试管上所标记的菌名接种相应的菌种，其中大肠杆菌2只，变形杆菌2只，另一只不接种，作为空白对照。

4）取乳糖发酵培养基试管5只，分别按其试管上所标记的菌名接种相应的菌种，其中大肠杆菌2只，变形杆菌2只，另一只不接种，作为空白对照。

5）将接种过的试管连同2只空白对照试管置于37℃的培养箱中培养24-48h。

6）观察各试管颜色变化及德汉氏试管中有无气泡。

1.2.3 IMVIC实验（大肠杆菌、产气大肠杆菌）
1）将配置好蛋白胨培养基和葡萄糖蛋白胨水培养基用记号笔表明培养基名称后进行灭菌并冷却到室温。

2）取六只蛋白胨培养基试管，在管壁上标注好将要接种的菌种名称，对应接种大肠杆菌3只，产气大肠杆菌3只。

3）取六只葡萄糖蛋白胨水培养基试管，在管壁上标注好将要接种的菌种名称，对应接种大肠杆菌3只，产气大肠杆菌3只。

4）将接种过的试管置于37℃的培养箱中培养24-48h。

5）向培养48h后的蛋白胨水培养基内加入适量乙醚，摇动数次，静置1min，待乙醚上升后，沿试管壁加入2滴吲哚试剂。

在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应（+）。

6）向培养48h后的葡萄糖蛋白胨水培养基培养物中加入甲基红试剂2滴，培养基变红色的为阳性（+），培养基变黄色的为阴性（-）。

2.结果与分析
2.1结果
2.1.1大分子物质的水解实验(铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、
金黄色葡萄球菌)
照片枯草芽
孢杆菌
铜绿假
单胞菌
大肠
杆菌
金黄色葡
萄球菌
淀粉水解
实验+ + - -
油脂水解
实验
+ + + -
淀粉水解阳性（+）为有水解圈；油脂水解实验阳性（+）为培养基由淡红色转变为红色。

2.2.2糖发酵试验
照片大肠杆
菌
普通变形菌对照
葡萄糖发
酵+ + - 乳糖发酵
+ - -
阳性（+）为产酸或产气，阴性（-）为不产酸活不产气；普通变形菌产气较少。

2.2.3 IMVIC实验
照片大肠杆
菌
普通变形
菌
对照
吲哚试
验+ - -
+ - - 甲基红
试验
吲哚试验阳性为有红色环状物，阴性无；甲基红试验阳性为培养基变红，阴性为培养基变黄
2.2分析
1．大分子物质的水解实验中，在淀粉培养基中，枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌周围产生大小、厚度一致的透明圈，说明这两种菌产生淀粉酶且两者的淀粉酶水解活性大致相同。

2．在葡萄糖发酵的试验中，发现大肠杆菌较普通变形菌产气较多，说明大肠杆菌分解葡萄糖的能力较普通变形菌的强。

3．在乳糖发酵的实验中，接种大肠杆菌试管中的德汉氏小管中有气泡存在，而普通变形菌中的没有气泡存在，说明大肠杆菌能够利用乳糖，而普通变形菌不能够将乳糖作为碳源
来利用。

4．在吲哚的实验中，有些接种大肠杆菌的试管中，在加入了乙醚后再滴加吲哚后并不显红色，可能是加入的乙醚的量把握不当或是乙醚和培养液没有充分震荡所致。

3．小结
本次试验基本成功，在这次实验中我们掌握了利用生理生化所微生物进行鉴定的方法，知道
了不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，并对微生物的一些代谢过程的原理有
所了解，且知道了对照组在实验中重要性。

4参考资料
沈萍陈向东实验室环境和人体表面的微生物检查微生物学实验【M】
高等教育出版社。