鸡传染性喉气管炎

鸡传染性喉气管炎( IL T) 是由喉气管炎病毒( IL TV) 引起的一种急性呼吸道传染病。

IL T 病变主要发生在喉头和气管部分,其特征性病变是呼吸困难,气喘,咳出血样渗出物,喉部和气管粘膜肿胀,严重者会导致糜烂和出血。

该病呈急性暴发和长期潜伏特性,现已遍布世界各地,
其发病率接近100 % ,死亡率10 %～40 %。

感染IL TV 会使蛋鸡的产蛋量下降和死亡率增加,给养鸡业造成严重损失,是集约化养鸡场易流行的重要疫病之一。

传染性喉气管炎是第一个被有效疫苗控制的禽病毒性疾病。

起初人们用强毒通过泄殖腔接种来使敏感鸡获得免疫，但是免疫鸡还能排毒，而成为传染源。

目前国内外主要采用弱毒疫苗来防制本病，尽管该疫苗具有良好的免疫效力，也比强度安全，但尚存在以下几方面不足：⑴现用的ILTV弱毒疫苗的毒力普遍偏强，接种后反应大。

因为它的免疫原性与毒力成正相关，如果毒力通过体外传代进一步降低，那么其免疫效力也随之下降。

⑵与ILTV强毒株一样ILTV弱毒疫苗也能导致潜伏感染，并且ILTV弱毒疫苗株在鸡群的传播过程中可能引起毒力反强，当它与非免疫鸡群接触时成为潜在的传染源，所以该弱毒疫苗仅限于本病流行地区使用，但非免疫鸡群一旦传入本病将导致重大损失。

⑶ILTV强弱毒尚无鉴别诊断方法。

由于ILTV现用弱毒疫苗存在问题，使ILT的完全控制仍然是养殖业的一大难题。

传统的方法已经不能解决现有鸡传染性喉气管炎弱毒疫苗存在的问题，所以需要开发研制一种具有与ILT弱毒疫苗同等效力又能克服弱毒疫苗上述不足的新型安全有效的ILT疫苗。

随着分子生物学技术的发展和日趋完善,利用基因工程疫苗来预防ILT 已经成为人们的共识。

ILTVgB基因与单纯疱疹病毒I型(HSV-1)病毒gB基因是同源基因，与HSV-1糖蛋白gB一样，ILTV糖蛋白gB也是一种跨膜蛋白，是病毒感染所必需的，在病毒接触和进入宿主细胞是起关键作用。

HSV糖蛋白gB已经被证明能够引起体液抗体和细胞介导的免疫应答，使免疫小鼠能够抵抗HSV强毒的致死性攻击。

ILTV糖蛋白gB基因能编码205Ku的糖蛋白复合物，由ILTV糖蛋白gB制备的亚单位疫苗能保护鸡100%抵抗临床发病和83%一直强度复制。

所有这些都表明，ILTV gB糖蛋白是主要保护性抗原，可作为研制亚单位疫苗、病毒活载体疫苗和DNA疫苗的候选抗原。

目前使用疫苗最大的问题是疫苗的免疫期短,此外,当有母源抗体存在时,许多疫苗的免疫
效果会受到干扰。

DNA 疫苗可以克服以上两种缺陷,被称为免疫学上的第三次革命[22 ] 。

DNA 疫苗又称基因疫苗,能激发机体的免疫反应,使之产生特异性抗体,它不仅可诱导体液免疫应
答,而且可诱导细胞免疫应答,并兼有亚单位苗的安全性和弱毒疫苗的高效性,已经成为国际疫
苗研究领域最热门的课题之一。

孟松树等[23 ]将分别含有鸡传染性喉气管炎病毒王岗株gB、gC、gD 基因的重组真核表达质粒及空载体质粒分组肌肉注射雏鸡,经过攻毒实验证明该重组质粒诱导了免疫应答,免疫保护率为79 % ,因此该基因疫苗可以作为预防IL T 的一个补充。

核酸疫苗（又称为基因疫苗）是近十年来新兴的一种疫苗，即利用病原的保护性抗原基因构建真核表达质粒，再将质粒DNA用肌肉注射或基因枪直接导入机体细胞，使外源基因通过机体内源性表达系统表达并提呈给宿主免疫系统，诱导产生特异性的免疫应答反应。

DNA疫苗尽管能够诱导机体产生Th1型免疫应答，但是他们在机体内表达量低，单独使用不足以产生有效的免疫保护效果，极大的限制了DNA疫苗所诱导产生的免疫应答程度。

因此应用佐剂来辅助DNA疫苗，以刺激机体产生强烈的免疫应答，使机体获得免疫保护。

然而，传统佐剂的固有缺点使DNA疫苗仍难达到理想的免疫效果。

因此寻找既能增强DNA疫苗的免疫原性，又安全、有效的新型佐剂成为当今新一代疫苗研究的热点。

研究表明，细胞因子具有明显的免疫佐剂效应，它们既可增强抗原的免疫原性，又可作用于体内免疫细胞，促进其分化、增殖，加强其活性与功能，以达到影响细胞内生物活性分子的表达与分泌，从而增强特异抗原的免疫原性或增强机体对抗原的反应性。

具有佐剂作用的细胞因子包括IL-1、IL-2、IFN-γ、GM-CSF、IL-6 、IL-12、IL-16、IL-18等。

白细胞介素-18(Interleukin-18,IL-18)是近年来新发现的一种重要的细胞免疫调节因子。

1995年Okamura等首次报告从中毒性休克的小鼠肝脏中获得了该因子，由于这种细胞因子能诱导Th1等细胞产生大量INF-γ，因而将其命名为干扰素诱生因子(interferon gamma inducing factor,IGIF)。

随后的研究表明该因子结构类似于IL-1家族而功能类似于L-12家族。

1996年Ushio 等从鼠cDNA库中筛选到人IGIF基因，并在大肠杆菌中表达，因其序列与所有已知的细胞因子不同，且生物活性多样，因此将其正式命名为白细胞介素-18。

研究表明IL-18可诱导INF-γ大量分泌、促进T、B淋巴细胞的分化、增强FasL的表达、激活NK细胞以及诱导产生IL-2、GM-CSF 等，是一种多效性细胞因子。

IL-18是由活化的巨噬细胞和肝脏枯否氏细胞产生的一种细胞因子，它能促进外周单核细胞产生IFN-γ、IL-2、GM-CSF等细胞因子，促进T细胞的分化与增殖，诱导Th1细胞分化成熟，在Th1细胞为主的细胞免疫反应中具有重要作用。

有资料显示，IL-18在DNA疫苗中具有明显的佐剂作用。

如Kim等（2001）构建了卵清蛋白（OV A）基因与IL-18基因共表达重组质粒pOV A/ IL-18，将此质粒免疫C57BL/6小鼠，检测OV A特异性IgG2a和IFN-γ的分泌，结果显示pOV A/ IL-18免疫组较pOV A组高，表明IL-18能够增强Th1型免疫应答，而且这种增强作用依赖于它与抗原的功质粒表达。

为了开发更为安全、有效的传染性喉气管炎基因工程疫苗，同时也为研制控制其它畜禽传染病的基因工程疫苗探索一条新途径，因此本研究进行鸡传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB与鸡IL-18基因重组真核表达质粒的构建与表达，并初步研究其免疫效力。

二、研究内容
1. 具体研究内容
①gB基因重组真核表达质粒pcDNA3.1/gB的构建。

②cIL-18基因重组真核表达质粒pcDNA3.1/ cIL-18的构建。

③gB与cIL-18基因重组真核共表达质粒pcDNA3.1/ gB-cIL-18的构建。

④重组pcDNA3.1/gB、pcDNA3.1/ cIL-18、pcDNA3.1/ gB-cIL-18的表达。

⑤免疫效力的研究。

2. 重点解决的问题
①重组真核表达质粒pcDNA3.1/gB、pcDNA3.1/ cIL-18、pcDNA3.1/ gB-cIL-18的构建与表达。

②重组真核表达质粒的转染。

③pcDNA3.1/gB、pcDNA3.1/ cIL-18、pcDNA3.1/ gB-cIL-18免疫效果观察。

3. 预期的研究结果
①成功构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/gB、pcDNA3.1/ cIL-18及共表达重组质粒pcDNA3.1/ gB-cIL-18。

②pcDNA3.1/gB、pcDNA3.1/ cIL-18、pcDNA3.1/ gB-cIL-18转染细胞后gB和cIL-18基因获得瞬时表达。

③细胞因子IL-18能够提高家禽抗感染免疫功能，为开发新型免疫佐剂，特别是鸡用基因工程疫苗的分子免疫佐剂奠定科学的基础。

三、研究方案设计
重组真核表达质粒pcDNA3.1/gB、pcDNA3.1/ cIL-18及共表达重组质粒pcDNA3.1/ gB-cIL-18。

重组质粒的转染
重组质粒的表达与鉴定
重组质粒对鸡的免疫试验
免疫保护的测定体液免疫的检测细胞免疫的检测
血清抗体IgG的ELISA检测T细胞活化试验
（MTT检测）
四、学位论文工作计划
①06.9-07.1重组真核表达质粒pcDNA3.1/gB、pcDNA3.1/ cIL-18及共表达重组质粒pcDNA3.1/ gB-cIL-18的构建。

②07.2-07.9重组真核表达质粒的转染、表达与鉴定。

③07.10-08.2重组鸡的免疫实验及检测。

④08.3-08.6论文撰写、参加论文答辩。