人脑胶质瘤干细胞的培养及分离方法
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
异有统 计学 意义 。
２ 结果
采用 ＳＳ Ｉ． 计软 件 。数据 Ｐ ＳＯ０统
胞 ， 入 无 血 清 培 养 基 Ｄ Ｍ／ １ ， 放 人 含 ５ 加 ＭＥ Ｆ２ 再 ％ Ｃ： Ｏ 的培养箱 中 ３ ７℃ 常规 培 养 。根 据 细胞 生 长 速 度 和培 养液 的 ｐ Ｈ值 变化 ， ３— 液 １次。 每 ４ｄ换
ｄ后可 见部分悬 浮细胞 形 成数 个 细胞 结 合在 一 起 的 细胞球 ， ５—７ｄ细 胞 球 进 一 步 增 大 ， 形 成 上 百 个 可 细胞 的大克 隆 ； 吹打 成 单 细 胞 悬 液 ， ３—５ ｄ后 可 见 吹散 后 的细胞 球 能 再 次 形 成新 的细 胞 球 。经 ３— ４
离心 １ ｉ， 新用 Ｐ Ｓ缓 冲液 重 悬 细 胞 。５ ０ ｔ ０ｒ ｎ 重 ａ Ｂ ０ ｌ ｘ 缓 冲液 洗柱 后 ， 细 胞 悬 液 过 柱 。过 柱 后 再 用 ５ ０ 将 ０
表 皮生 长 因 子 （ Ｇ ， 性 成 纤 维 细 胞 生 长 因 子 Ｅ Ｆ） 碱 （ Ｆ Ｆ ， 蛋 白 （ ｅｔ ） 体 ， 质 原性 纤 维 酸 蛋 ｂ Ｇ ）巢 Ｎ ｓｎ 抗 ｉ 胶 白（ Ｆ Ｐ 抗体 ， ＧＡ ） 磁珠 细胞 分选 系统 ，Ｅ标 记 的小 鼠 Ｐ 抗 人 Ｃ 抗体 抗 Ｐ Ｄ３ ３ Ｅ磁 珠 ，Ｅ标 记 的小 鼠 ＩＧ Ｐ ｇ。 １２ 胶 质瘤 干细 胞 的培 养 在无 菌 状 态 下 收集 人 ． 脑 胶质 瘤手术 标本 ， 制成 单 细 胞悬 液 后 调 整细 胞 浓 度为（． ０ ５—１０ 。 ）×１ 。ｍ ， ６孔 培 养 板上 种 植 细 ０／ ｌ在
关键词 ： 胶质瘤 ； 干细胞 ； 培养方法 ； 分离方法
中 图 分 类 号 ：７ ９ ４ １ ３．１ １ 文 献 标 志 码 ： Ｂ 文章 编 号 ：０ ２２ ６ ２ １ ）２ ３３ ４２ １０ －６ Ｘ（０ ０ ０ ４ ６ ３ ０
脑胶 质瘤 恶性程 度 高 、 发生侵袭转 移 ， 切 易 手术
山东医药 ２ １ ００年第 ５ 卷第 ２ Ｏ 期
人 脑胶 质 瘤 干 细胞 的培养 及 分 离 方 法
惠小 波 于如 同 王 ， ， 雷
（ １淮安 市第 一人 民 医院 ， 苏淮安 ２３０ ； 州 医学 院附属 医院 ； 江 ２３０２徐
３徐 州矿务 局 总 医院）
摘要 ： 目的
探讨人 脑胶 质瘤 干细胞的培养和分离方 法。方法 取脑胶 质瘤手术 标本 ， 制成单 细胞悬液 用无
培 养和 分离方 法 ， 作复 杂 ． 操 获取 的脑胶 质瘤 干细胞 少 。２０ ０ ８年 ３一ｌ ２月 ， 们 对脑 胶 质瘤 干 细胞 的 培 我 养 和分离 方法 进行 了改进 。现报 告如 下 。
１ 材 料 与方法
稀 释 比例加 入 Ｐ Ｅ标 记 的 小 鼠抗人 Ｃ ｍ抗 体 ， Ｄ ４℃
血清培养 基培养 ， 加入表 皮生长 因子 （ Ｇ ） 碱性成 纤维细胞 生长因子 （ Ｆ Ｆ 进行诱 导分化 ； ＥＦ、 ｂＣ ） 用免疫 组化法 检测 巢蛋白（ ｅｔ ） Ｎ ｓｎ 和胶 质原性纤 维酸蛋 白（ Ｆ Ｐ ； 免疫磁珠 分选系统进 行 细胞分离 ， 式细胞 仪 检测 分化前 后 ｉ Ｇ Ａ ）用 流
和细胞 球 分 化情 况 。６ｈ后选 取 盖 玻 片 ， 疫 组 织 免
化学法 检 测 胶 质 瘤 干 细胞 的 Ｎ ｓｎ Ｇ Ａ 按 说 明 ｅｔ 、 Ｆ Ｐ， ｉ
２ １ 脑 胶质 瘤干 细胞 的培 养结 果 原 代 培 养 细 胞 ．
在无血 清培 养基 中 ， 单 个 细胞 大 量 减少 ， ４ ２ｄ后 ３～
Ｃ Ⅲ阳性 细胞 的比率 。结果 Ｄ 培养 出悬 浮生长 的人脑胶质瘤干细胞球 ， ｅｔ 表达呈 阳性 ， Ｎｓｎ ｉ 分化后 Ｇ Ａ Ｆ Ｐ表达呈 阳 无血清培养 法 、 性； 分离前 Ｃ ｍ阳性细胞百分 比为 ４ ６ ％ ± ．５ ， Ｄ ． ６ ０ ５ ％ 分离后为８ ． １ ± ．７ ， ０ ０ 。结论 ７ ２ ％ ６ １％ Ｐ＜ ．５ 免疫磁珠 分选 系统 可成功培养和分离人脑胶质瘤干用 ｔ 验 。Ｐ≤０ ０ 为 差 组 检 ．５
１３ 胶质瘤干细胞的诱导分化和鉴定 选取生长 。 情 况 良好 的细胞球 悬 液 ， 植 于 ６孔 板 内的盖 玻 片 种 上 （ 多聚赖 氨酸 预处理 过 ） 以含 Ｅ Ｆ ｂ Ｇ 、０ 经 ， Ｇ 、Ｆ Ｆ １ ％ 胎牛血 清 的 Ｄ Ｍ／ １ 养液 培养 ， 察细 胞贴 壁 ＭＥ Ｆ ２培 观
１１ 实验 材料 ．
无 血清 培 养基 Ｄ Ｅ ／ １ （ ： ） Ｍ Ｍ Ｆ２ １ １ ，
避光孵育 １ ｍｎ ， Ｐ Ｓ ５ ｉ 后 用 Ｂ 缓冲液洗涤细胞 ２次去 除多余 的抗体 。用 Ｐ Ｓ缓 冲液重 悬 细胞 ， １５的 Ｂ 按 ： 稀 释 比例 加人抗 Ｐ Ｅ磁 珠 ， 合 均匀 后 ， ℃ 避光 孵 ｝ 昆 ４ 育 １ ｉ ， ５ｍ ｎ 加入 Ｐ Ｓ缓 冲 液冼 涤 细 胞 。１０ ０ ｒｍ ｎ Ｂ ０ ／ ｉ
除后 复 发率较 高 。脑 胶质 瘤 干 细胞 的发 现 ， 为胶 质
１４ 脑胶 质瘤 干细胞 的分 离 ．
采 用 免疫 磁 珠 分 选
系统分离 。取 生长 状 态 良好 的脑 胶质 瘤 干 细 胞球 ，
镜 下计数 １ ０ 个 细胞 ， ×１ 严格 无菌 操作 ， １ １ 按 ： １的
瘤 的治疗 提供 了新方 向。但 目前 脑胶质 瘤于 细胞 的
ｌ 冲液洗 柱 ３次 以去 除 非 标 记 阴 性 细 胞 。然 后 缓 移 柱 出磁场 。１ｍ 缓 冲 液 洗 柱 ， 泵 加 压 ， 后 收 ｌ 用 最
集 的洗 液 即是 Ｃ 阳性 细 胞 。采 用 流 式 细 胞 仪检 Ｄ
测分离 前后 Ｃ Ｄｍ阳性 细胞 的 比率 。
１５ 统 计学 方法 ．
２ 结果
采用 ＳＳ Ｉ． 计软 件 。数据 Ｐ ＳＯ０统
胞 ， 入 无 血 清 培 养 基 Ｄ Ｍ／ １ ， 放 人 含 ５ 加 ＭＥ Ｆ２ 再 ％ Ｃ： Ｏ 的培养箱 中 ３ ７℃ 常规 培 养 。根 据 细胞 生 长 速 度 和培 养液 的 ｐ Ｈ值 变化 ， ３— 液 １次。 每 ４ｄ换
ｄ后可 见部分悬 浮细胞 形 成数 个 细胞 结 合在 一 起 的 细胞球 ， ５—７ｄ细 胞 球 进 一 步 增 大 ， 形 成 上 百 个 可 细胞 的大克 隆 ； 吹打 成 单 细 胞 悬 液 ， ３—５ ｄ后 可 见 吹散 后 的细胞 球 能 再 次 形 成新 的细 胞 球 。经 ３— ４
离心 １ ｉ， 新用 Ｐ Ｓ缓 冲液 重 悬 细 胞 。５ ０ ｔ ０ｒ ｎ 重 ａ Ｂ ０ ｌ ｘ 缓 冲液 洗柱 后 ， 细 胞 悬 液 过 柱 。过 柱 后 再 用 ５ ０ 将 ０
表 皮生 长 因 子 （ Ｇ ， 性 成 纤 维 细 胞 生 长 因 子 Ｅ Ｆ） 碱 （ Ｆ Ｆ ， 蛋 白 （ ｅｔ ） 体 ， 质 原性 纤 维 酸 蛋 ｂ Ｇ ）巢 Ｎ ｓｎ 抗 ｉ 胶 白（ Ｆ Ｐ 抗体 ， ＧＡ ） 磁珠 细胞 分选 系统 ，Ｅ标 记 的小 鼠 Ｐ 抗 人 Ｃ 抗体 抗 Ｐ Ｄ３ ３ Ｅ磁 珠 ，Ｅ标 记 的小 鼠 ＩＧ Ｐ ｇ。 １２ 胶 质瘤 干细 胞 的培 养 在无 菌 状 态 下 收集 人 ． 脑 胶质 瘤手术 标本 ， 制成 单 细 胞悬 液 后 调 整细 胞 浓 度为（． ０ ５—１０ 。 ）×１ 。ｍ ， ６孔 培 养 板上 种 植 细 ０／ ｌ在
关键词 ： 胶质瘤 ； 干细胞 ； 培养方法 ； 分离方法
中 图 分 类 号 ：７ ９ ４ １ ３．１ １ 文 献 标 志 码 ： Ｂ 文章 编 号 ：０ ２２ ６ ２ １ ）２ ３３ ４２ １０ －６ Ｘ（０ ０ ０ ４ ６ ３ ０
脑胶 质瘤 恶性程 度 高 、 发生侵袭转 移 ， 切 易 手术
山东医药 ２ １ ００年第 ５ 卷第 ２ Ｏ 期
人 脑胶 质 瘤 干 细胞 的培养 及 分 离 方 法
惠小 波 于如 同 王 ， ， 雷
（ １淮安 市第 一人 民 医院 ， 苏淮安 ２３０ ； 州 医学 院附属 医院 ； 江 ２３０２徐
３徐 州矿务 局 总 医院）
摘要 ： 目的
探讨人 脑胶 质瘤 干细胞的培养和分离方 法。方法 取脑胶 质瘤手术 标本 ， 制成单 细胞悬液 用无
培 养和 分离方 法 ， 作复 杂 ． 操 获取 的脑胶 质瘤 干细胞 少 。２０ ０ ８年 ３一ｌ ２月 ， 们 对脑 胶 质瘤 干 细胞 的 培 我 养 和分离 方法 进行 了改进 。现报 告如 下 。
１ 材 料 与方法
稀 释 比例加 入 Ｐ Ｅ标 记 的 小 鼠抗人 Ｃ ｍ抗 体 ， Ｄ ４℃
血清培养 基培养 ， 加入表 皮生长 因子 （ Ｇ ） 碱性成 纤维细胞 生长因子 （ Ｆ Ｆ 进行诱 导分化 ； ＥＦ、 ｂＣ ） 用免疫 组化法 检测 巢蛋白（ ｅｔ ） Ｎ ｓｎ 和胶 质原性纤 维酸蛋 白（ Ｆ Ｐ ； 免疫磁珠 分选系统进 行 细胞分离 ， 式细胞 仪 检测 分化前 后 ｉ Ｇ Ａ ）用 流
和细胞 球 分 化情 况 。６ｈ后选 取 盖 玻 片 ， 疫 组 织 免
化学法 检 测 胶 质 瘤 干 细胞 的 Ｎ ｓｎ Ｇ Ａ 按 说 明 ｅｔ 、 Ｆ Ｐ， ｉ
２ １ 脑 胶质 瘤干 细胞 的培 养结 果 原 代 培 养 细 胞 ．
在无血 清培 养基 中 ， 单 个 细胞 大 量 减少 ， ４ ２ｄ后 ３～
Ｃ Ⅲ阳性 细胞 的比率 。结果 Ｄ 培养 出悬 浮生长 的人脑胶质瘤干细胞球 ， ｅｔ 表达呈 阳性 ， Ｎｓｎ ｉ 分化后 Ｇ Ａ Ｆ Ｐ表达呈 阳 无血清培养 法 、 性； 分离前 Ｃ ｍ阳性细胞百分 比为 ４ ６ ％ ± ．５ ， Ｄ ． ６ ０ ５ ％ 分离后为８ ． １ ± ．７ ， ０ ０ 。结论 ７ ２ ％ ６ １％ Ｐ＜ ．５ 免疫磁珠 分选 系统 可成功培养和分离人脑胶质瘤干用 ｔ 验 。Ｐ≤０ ０ 为 差 组 检 ．５
１３ 胶质瘤干细胞的诱导分化和鉴定 选取生长 。 情 况 良好 的细胞球 悬 液 ， 植 于 ６孔 板 内的盖 玻 片 种 上 （ 多聚赖 氨酸 预处理 过 ） 以含 Ｅ Ｆ ｂ Ｇ 、０ 经 ， Ｇ 、Ｆ Ｆ １ ％ 胎牛血 清 的 Ｄ Ｍ／ １ 养液 培养 ， 察细 胞贴 壁 ＭＥ Ｆ ２培 观
１１ 实验 材料 ．
无 血清 培 养基 Ｄ Ｅ ／ １ （ ： ） Ｍ Ｍ Ｆ２ １ １ ，
避光孵育 １ ｍｎ ， Ｐ Ｓ ５ ｉ 后 用 Ｂ 缓冲液洗涤细胞 ２次去 除多余 的抗体 。用 Ｐ Ｓ缓 冲液重 悬 细胞 ， １５的 Ｂ 按 ： 稀 释 比例 加人抗 Ｐ Ｅ磁 珠 ， 合 均匀 后 ， ℃ 避光 孵 ｝ 昆 ４ 育 １ ｉ ， ５ｍ ｎ 加入 Ｐ Ｓ缓 冲 液冼 涤 细 胞 。１０ ０ ｒｍ ｎ Ｂ ０ ／ ｉ
除后 复 发率较 高 。脑 胶质 瘤 干 细胞 的发 现 ， 为胶 质
１４ 脑胶 质瘤 干细胞 的分 离 ．
采 用 免疫 磁 珠 分 选
系统分离 。取 生长 状 态 良好 的脑 胶质 瘤 干 细 胞球 ，
镜 下计数 １ ０ 个 细胞 ， ×１ 严格 无菌 操作 ， １ １ 按 ： １的
瘤 的治疗 提供 了新方 向。但 目前 脑胶质 瘤于 细胞 的
ｌ 冲液洗 柱 ３次 以去 除 非 标 记 阴 性 细 胞 。然 后 缓 移 柱 出磁场 。１ｍ 缓 冲 液 洗 柱 ， 泵 加 压 ， 后 收 ｌ 用 最
集 的洗 液 即是 Ｃ 阳性 细 胞 。采 用 流 式 细 胞 仪检 Ｄ
测分离 前后 Ｃ Ｄｍ阳性 细胞 的 比率 。
１５ 统 计学 方法 ．