造血干细胞分离培养方法
CD34+ 细胞及分离方法
目前常用于分离CD34+细胞的方法主要 是免疫吸附法（ systems based on immunoadsorption)。 尤其是用免疫磁珠吸附分离（immune adsorption on ferromagnetic beads) 的方法应用更为广泛。
CD34+细胞分离方法比较
分离方法 荧光激活细 胞计数 免疫磁珠吸 附分离 细胞物理特 性分离 细胞得率 难易程度 细胞纯度 分离速度 条件 少 大 低 难 易 易 高 高 低 慢 快 快 高 经济 经济
分离CD34ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ细胞的方法
荧光激活细胞分选 免疫吸附系统 （淘选法；免疫吸附柱层析 法；免疫磁珠法） 细胞物理参数系统（密度梯度离心法；离心计 数流式法）
流式细胞分选(fluorescence activated cell sorting,FACS)可获 得高纯度的CD34+细胞，但是由于 得量较少，受无菌实验条件等方面 的限制，所以应用较少。 细胞物理参数系统分离CD34+细胞 得率较低，而且需要提供足够的细 胞量。
免疫磁珠吸附分离CD34+细胞
利用抗CD34单克隆抗体与抗原特异结合 的特性，通过二抗介导的免疫磁珠结合， 使用Miltenyi的磁性细胞分离仪，有效的 分离纯化CD34+细胞，进一步用于造血 细胞培养，扩增，基因转染，建立造血 干细胞库等实验。
实验材料：
1.脐带血，外周血及骨髓标本； 2.PBS缓冲溶液； 3.10%BSA； 4.10mmol/LEDTA； 5.淋巴细胞分离液； 6.MACS磁性分离仪； 7.MACS分离试剂盒；
造血干细胞分离培养方法
一造血干细胞分离（一）小鼠骨髓采集与单个核细胞悬液的制备1 HES(羟乙基淀粉)沉淀法抽取髓液500 m L按4∶1比例加入HES，自然沉降红细胞后，分离上清。
4℃400 g离心10 min得细胞沉淀物，以1 %白蛋白盐水液洗涤细胞2次。
2 percoll液密度梯度离心法①按体积比为(1.5～2)∶1在骨髓液中加入淋巴细胞分离液。
4℃,1 5 00 r / min，离心20 min。
取单个核细胞层，以1%白蛋白盐水液洗涤3次。
②取鼠股骨和胫骨, 在两头关节处切开骨骼, 反复用培养基冲洗骨髓腔, 随后小心地逐滴将细胞悬液加在淋巴细胞分离液上, 2 000 r / min 离心20 min。
吸取离心后相交液面处的白色细胞层即为单个核细胞。
3 Ficoll分离法方法一在15ml分离管中加7.5ml比重为1.017的Ficoll液，缓慢移入等量骨髓细胞悬液，整体平衡后低温离心2000r/min×20min,吸取白细胞层，用RPMI1640液亲清洗后离心2000r/min×10min,取白细胞层加RPMI1640液到10ml制成造血干细胞悬液样本。
方法二取无菌离心管1支，预先添加3mlFicoll(与骨髓细胞悬液体积1:1)，用滴管取单细胞悬液3ml，沿离心管壁小心缓慢叠加于分离液面上，注意保持清楚的界面，室温下水平离心2000rpm×20分钟，（后续在冰上进行）用毛细吸管插到云雾层，小心吸取单个核细胞，置入另一短中管中，加入5倍以上体积的磷酸缓冲液PBS，1500rpm×10分钟，L-DMEM 洗涤细胞两次，每次以1000r/min离心10min，去上清液。
（除第一步的室温离心外，其余为低温离心）。
取骨髓细胞悬液的方法是：取出大鼠腿骨将肌肉尽可能剔除，并用PBS缓冲液冲洗干净。
在超净台中腿骨浸泡在PBS缓冲液中5min，之后在两头关节处切开骨骼, 反复用PBS 缓冲液冲洗骨髓腔，从而得到骨髓细胞悬液。
造血细胞分离、集落培养及表型分析
造血细胞分离、集落培养及表型分析所谓造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSC，）是指具有自我更新和多向分化能力的一类细胞。
它的基本特性是具有自我更新能力，即经过一个细胞周期活动之后，可以产生两个与分裂前性质相同的造血干细胞,同时又具有多向分化能力，即在一定的环境条件下，造血干细胞具有向各系血细胞分化的能力。
图1 造血系统和造血干细胞分化图Fig。
1 hematopoietic system and hematopoietic stem cell differentiation.造血干细胞主要存在于骨髓、动员的外周血、脐血中，与骨髓和动员的外周血相比，脐血来源丰富、受病毒污染的几率小、富含造血干细胞且所含的造血干细胞具有更高的增殖潜能，同时脐血中的淋巴细胞幼稚，具有较低的免疫排斥活性，是优良的造血干细胞来源。
造血干/祖细胞鉴别的传统方法还是应用集落分析方法，它可检测粒-巨嗜细胞集落形成单位（colony - forming unit-granulocyte/ macrophage，CFU-GM）、红系爆式集落形成单位（burst-forming unit-erythroid，BFU-E）、巨核细胞集落形成单位（colony-forming unit-megakaryocyte，CFU-MK）、红系-粒系-巨嗜系-单核系集落形成单位（multipotent colony-forming units，CFU-GEMM或mixed colony-forming unit，CFU-Mix），等等，它是在半固体培养基上培养14天，然后在显微镜下计数集落。
造血干细胞的表面标志随着个体发育的不同时期不同，CD34+、CD38-、HLA-DR-、Thy-1+、c-kit+、LFA-1-、CD45RA-、CD71-、lin-已经普遍被认为是造血干细胞的标志。
此外，1997年发现一个新的造血干细胞标志是AC133，但具CD34抗原是目前公认的造血干细胞和祖细胞的共同标志。
分离人外周血造血干细胞的实验记录
分离人外周血造血干细胞的实验记录一、分离方法说明及图例A.Ⅰ.取新鲜抗凝血液或脐带血与羟乙基淀粉550（Cat#：HES-TBD550）按1:1比例混合，37℃反应5-10分钟（5ml以下样本反应5分钟，5ml以上样本反应10分钟）；Ⅱ.取新鲜抗凝骨髓，加入一份细胞洗涤液（Cat#：2010X1118），混匀后以400g（约1500转/分）离心5分钟，弃去上清。
沉淀与羟乙基淀粉550（Cat#：HES-TBD550）按1:1比例混合，37℃反应5-10分钟（5ml以下样本反应5分钟，5ml以上样本反应10分钟）；B.加入为步骤A中所得混合液1/2体积的全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）混匀20℃-30℃自然沉降20-30分钟，吸取上清备用；C.向步骤B中所得上清液中加入为其一倍以上体积的细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）混匀，以500g（约1800转/分）离心15分钟（半径15cm水平转子），弃去上清保留沉淀细胞；D.向细胞沉淀中加入全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）调整细胞浓度为2×108—1×109个/ml，小心叠加于细胞分离液（本实验采用的是天津灏洋TBD实验室的分离液）之液面上（混合液：分离液=2:1）；E.以400g（约1500转/分）离心20分钟（半径15cm水平转子）；第三层；为透明分离液层。
第四层；为极少数红细胞层。
收集第二层细胞放入约为其5-10倍体积的细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）中，充分混匀后以500g（约1800转/分）离心1 5分钟。
沉淀经反复洗涤2次既得所需干细胞。
F.为获得纯度更高的干细胞，在步骤E中离心完成后可吸取第二层干细胞层再与羟乙基淀粉550（Cat#：HES-TBD550）按1:1比例混匀，20℃-30℃自然沉降20-30分钟，收集上清加入细胞洗涤液500g（约1800转/分）离心15分钟。
原代造血干细胞培养
原代造血干细胞培养
1. 细胞来源，造血干细胞可以从骨髓、外周血或者胎盘等多种来源获得，不同来源的细胞可能有不同的特性，需要根据实验目的选择合适的来源。
2. 细胞分离，从原代组织中分离出造血干细胞需要使用适当的分离方法，比如密度梯度离心、免疫磁珠分选等，以保证分离的细胞具有较高的纯度和活力。
3. 培养条件，原代造血干细胞在体外培养时需要提供适当的营养物质、生长因子和培养基，同时也需要控制适当的温度、湿度和气体环境，以提供良好的生长条件。
4. 培养监测，在培养过程中需要定期观察细胞的形态、增殖情况和表型特征，以及对细胞进行鉴定和纯度检测，确保培养的细胞符合实验要求。
5. 应用领域，原代造血干细胞培养在干细胞治疗、造血系统疾病研究、药物筛选等领域具有重要的应用前景，可以为相关疾病的治疗和研究提供重要的实验材料。
综上所述，原代造血干细胞培养是一项复杂而重要的实验技术，需要在细胞来源、分离方法、培养条件和监测等方面进行严格的操
作和控制，以确保获得高质量的细胞用于后续的研究和应用。
造血细胞分离、集落培养及表型分析
五、实验结果
脐血的体积
样品
分离出的单个 核细胞液的细
胞密度 9.8625×107 个
/mL
表 1 血球计数板计数结果
脐血中单个核 脐血中单个核 脐血中单个核
细胞液体积 细胞液细胞密 细胞液白细胞
度
密度
30mL
3.15×109 个/mL 3.9625×108 个
分离出的单个 核细胞液的白
收率(总细胞)
/mL 收率(白细胞)
细胞密度
5.1×106 个/mL
0.16%
0.064%
分离出的单个 核细胞液的体
积 1.5mL
纯度
12.26%
1、脐血共稀释 10,000 倍，利用血球计数板计数结果如下
38 28
27 34
40 30
16 39
(38+28+27+34+40+30+16+39)÷8=31.5 31.5×10000×104=3.15×109 个/mL
以总细胞计：9.8625×107×1.5÷(3.15×109×30)=0.16%
以白细胞计：5.1×106×1.5÷(3.9625×108×30)=0.064%
6、纯度
3.15×109×60=12.26%
5.2 流式细胞分析结果
5.2.1 流式细胞分析结果图
图 1 C流式细胞分析结果
33 30
25 32
32 24
(47+40+33+30+25+32+32+24)÷8=32.875 32.875×300×104=9.8625×107 个/mL
4、分离裂解后共稀释 30 倍，利用血球计数板计数结果如下
造血干细胞体外培养
造血干细胞体外培养
在进行造血干细胞体外培养时，首先需要从骨髓、外周血或者
胎盘血等来源中获得含有造血干细胞的细胞样本。
然后，这些细胞
样本会被经过特定的处理和分离步骤，将造血干细胞分离出来。
接
下来，这些分离出来的造血干细胞会被放入含有适当营养物质和生
长因子的培养基中进行培养。
培养基的配方和条件需要精确控制，
以提供细胞增殖和生长所需的理想环境。
在体外培养的过程中，研究人员需要定期检测和评估造血干细
胞的生长状态、纯度和活性。
他们可能会对培养条件进行调整，以
确保造血干细胞能够在体外保持其干细胞特性和功能。
造血干细胞体外培养的成功对于临床移植和疾病治疗具有重要
意义。
通过体外培养，可以获得足够数量和质量的造血干细胞，用
于移植到需要再生造血系统的患者体内，如白血病或骨髓衰竭患者。
此外，体外培养也为研究人员提供了研究和了解造血干细胞生物学
特性的重要工具，有助于深入探究造血系统疾病的发病机制和开发
新的治疗方法。
总的来说，造血干细胞体外培养是一个复杂而重要的过程，它
在临床和科研领域都具有重要意义，对于促进医学进步和治疗疾病具有深远影响。
造血干细胞体外培养
造血干细胞体外培养
首先，造血干细胞体外培养的过程通常涉及到从骨髓、外周血或者脐带血等来源中分离出造血干细胞。
这些干细胞随后会被置于含有适当营养物质和生长因子的培养基中进行培养。
培养基的配方需要精确控制，以提供适当的营养和环境条件来促进干细胞的增殖和分化。
其次，体外培养的过程中需要严格控制培养条件，包括温度、湿度、氧气浓度等因素。
这些条件对于干细胞的生长和分化至关重要，因此需要精确监控和调节。
此外，体外培养的过程也需要考虑到细胞的纯度和活性。
在培养过程中，需要定期检测和评估干细胞的纯度和活性，以确保其符合临床应用的要求。
在实际应用中，体外培养的造血干细胞可以用于干细胞移植，用于治疗白血病、淋巴瘤、贫血等血液系统疾病。
此外，体外培养的造血干细胞也被用于研究干细胞生物学以及药物筛选等领域。
总的来说，造血干细胞体外培养是一项复杂而重要的技术，它
为干细胞移植和血液系统疾病治疗提供了重要的支持，同时也推动了干细胞生物学和临床应用的发展。
随着技术的不断进步，相信体外培养技术将在未来发挥更加重要的作用。
造血干细胞表型及分离纯化方法
02
不同部位AA的长度为：
所谓表位是指同一抗原分子上有不同的抗原识别位点。目前有My-10, BI-3c5, 12.8, ICH-3, TUK , 115.2 等单抗识别的位点。前四株识别的表位取决于 sialic acid residues, 后二者却不 一样。
01
CD34分子的epitopes
hematopoietic stem and progenitor cells. neural and embryonic stem cells. some leukemias and brain tumours that may be derived from stem cells. Low level expression could also be detected in the kidney, pancreas, placenta, and fetal liver.
CD34+CD10+CD19+ (前B)；
CD34+CD5+CD7+ (前T)；
CD34+CD71+CD45RO+ (红前)；
CD34+CD41+(巨前)；
CD34+CD13+CD33+CD45RA+ (髓前)
不同CD34阳性细胞亚群
较原始干细胞亚群的免疫表型一般为：
(Rhodamine 123 Dull)
推测，在造血早期，CD34分子的作用可能与干细胞之间或干细胞与基质细胞之间的接触、通信和相互作用有关。
01
02
(2) 细胞间接触、通信和相互作用
Civin小组证实，CD34可由激活的PKC迅速磷酸化，激活的PKC能刺激CD34阳性前体细胞CD34上调，这种上调独立于内质网内CD34的转录和转换。可见，CD34磷酸化是细胞表面上调的扳机，PKC活化是生长因子配体-受体结合启动胞浆信号转导级联的一个成分。
分离培养干细胞的方法分类
分离培养干细胞的方法分类
分离培养干细胞的方法主要可以分为以下几类：
1. 最常见的方法为机械分离法，利用组织或细胞的物理性质进行分离。
例如在骨髓中分离造血干细胞时，可以利用胶体或其他分离物质将骨髓细胞进行分层，然后将不同层次的细胞进行分离。
2. 免疫选择法，利用单克隆抗体的特异性结合，将目标细胞从混合细胞中分离出来。
例如在胎盘组织中分离胚胎干细胞时，可以利用特异性的单克隆抗体识别胚胎干细胞表面的记号分子，然后利用磁性微珠等手段将这些细胞分离出来。
3. 化学处理法，利用化学或药物物质的特性，直接或间接地影响目标细胞的生长与分裂。
例如在胚胎干细胞的培养中，可以利用衍生自自然化合物的小分子化合物，来调控细胞的生长与分裂。
4. 细胞团块培养法，利用干细胞的自我复制和自我更新的特点，在培养基中形成球状细胞团，然后分离出内部细胞团中的干细胞。
例如在胚胎干细胞的分离中，可以将早期发育阶段胚胎的内细胞团分离出来进行培养。
以上是几种干细胞分离与培养方法的分类和简要介绍。
7.造血干细胞表型及分离纯化方法
较差，完全缓解率及存活率低，传统的
化疗方案治疗效果可能不好。
4.CD34阳性细胞亚群
根据细胞表面抗原表达的情况，可 将CD34阳性细胞分为许多亚群，这些细 胞多数已定向到特定细胞系。 与CD34共表达，可作为干细胞进一 步分型依据的抗原有：CD38、CD10、 CD19、CD5、CD7、CD71、CD45、 CD41、CD13、CD33等。
MACS-isolated CD133+ cells became adherent and CD133- during cultivation, but gave rise to nonadherent CD133+ cells budding from the adherent cell surface by a symmetric cell division. Cells were stained with CD133/1 (AC133)-PE.
之后，其他研究小组也相继研制 出12.8; BI-3c5; ICH-3等类似抗体。 1986年，这些抗体被命名为CD34， 为目前公认的干细胞的重要标志。 CD34抗原的发现促进了造血干 细胞研究的深入和发展，是一重要的 里程碑事件。
本次课的主要内容
一.造血细胞的表型 CD34；Sca-1；Thy-1；Lin-；c-kit 二.造血细胞分离方法 FACS；磁柱分离；亲合分离； Panning
97kDa的糖蛋白，包括5个跨膜结 构域， 糖基化后在蛋白胶上显示120 kDa的蛋白带。最初是通过AC133单抗 鉴定的，它能识别人HSCs的CD34+亚 类29,30。一种CD133异构体AC133-2, 最近已经被克隆并鉴定为可被AC133抗 体识别的原始表面抗原。
人骨髓造血干细胞的分离培养
人骨髓造血干细胞的分离培养是一个复杂而重要的过程，涉及到细胞生物学、分子生物学和生物工程等多个领域。
以下是对该过程的详细描述，共计800字。
一、分离骨髓造血干细胞首先，我们需要从捐献者的骨髓中分离出造血干细胞。
通常，捐献者需要接受全身麻醉，然后在医生的监督下抽取一定量的骨髓。
抽取的骨髓样本经过处理后，会分离出造血干细胞和其他类型的细胞。
这一过程通常需要使用到离心技术，如密度梯度离心法。
二、培养造血干细胞分离出的造血干细胞需要在一个适合它们生长和分化的环境中进行培养。
实验室环境通常需要具备以下几个条件：1. 合适的营养物质：造血干细胞需要特定的营养物质来维持它们的生长和分化。
这些营养物质包括氨基酸、葡萄糖、维生素、矿物质和生长因子等。
2. 适合的pH值和渗透压：造血干细胞对环境的pH值和渗透压非常敏感。
过高的pH值或渗透压可能导致细胞死亡或停止生长。
3. 适合的温度：温度是影响细胞生长和分化的重要因素。
适宜的温度可以使造血干细胞保持最佳的分裂状态。
在培养过程中，造血干细胞会逐渐分裂并形成更多的细胞，同时也会分化为不同类型的血细胞，如红细胞、白细胞和血小板等。
为了确保造血干细胞的生长和分化，通常会使用一些细胞因子，如集落刺激因子（CSF）和红细胞生成素（EPO）等。
这些细胞因子可以刺激造血干细胞增殖并抑制其分化为非造血细胞。
三、观察和记录在培养过程中，我们需要密切关注细胞的生长状况，并定期进行观察和记录。
可以通过显微镜观察细胞的形态变化，测量细胞生长的速度和数量，以及检查细胞分化的程度。
通过这些观察结果，我们可以了解细胞的生长状态，及时调整培养条件，以确保造血干细胞的最佳生长。
四、提取和分析干细胞克隆当造血干细胞在适当的条件下生长和分化时，可能会形成独立的细胞克隆。
这些克隆可以用于进一步的研究和药物开发。
可以通过克隆培养、基因敲除、基因表达分析等方法对干细胞克隆进行深入研究。
这些研究可以帮助我们更好地了解造血干细胞的生理特性，并为相关疾病的治疗提供新的思路和方法。
造血细胞分离、集落培养及表型分析
造血细胞分离、集落培养及表型分析动性好，同时也避免了细胞因受力而损伤的情况。
流式细胞仪通过激光束照射细胞，检测细胞表面标记物的荧光强度，进而分析细胞表型，包括细胞表面标志、大小、形态等。
2、集落培养集落培养法是一种常用的检测造血干细胞的方法。
将待测细胞在半固体培养基中培养，待细胞分裂形成集落后，根据集落的形态和数量来判断细胞的分化能力。
常用的集落包括粒-巨嗜细胞集落形成单位（CFU-GM）、红系爆式集落形成单位（BFU-E）、巨核细胞集落形成单位（CFU-MK）等。
集落培养法可以检测细胞的增殖能力和分化潜能，是评估细胞功能的重要方法。
二、实验步骤1、细胞样品制备将待测细胞制成单细胞悬液，使得细胞可以均匀地分布在流式细胞仪的流动室中，方便后续的细胞表型分析。
2、流式细胞仪分析将制备好的细胞悬液加入样品管中，加入特异性荧光染料后，通过流式细胞仪进行细胞表型分析。
根据细胞表面标志物的荧光强度，可以判断细胞的类型和状态。
3、集落培养将待测细胞在半固体培养基中培养，待细胞分裂形成集落后，根据集落的形态和数量来判断细胞的分化能力。
常用的集落包括粒-巨嗜细胞集落形成单位（CFU-GM）、红系爆式集落形成单位（BFU-E）、巨核细胞集落形成单位（CFU-MK）等。
三、实验结果分析通过流式细胞仪和集落培养的结果，可以分析细胞的表型和功能。
例如，CD34+、CD38-、HLA-DR-、Thy-1+、c-kit+、LFA-1-、CD45RA-、CD71-、lin-等标志物被广泛认为是造血干细胞的标志。
同时，集落培养的结果也可以评估细胞的增殖能力和分化潜能。
这些结果对于研究造血干细胞的生物学特性和临床应用具有重要意义。
本实验采用流式细胞仪技术对脐血中的造血干细胞进行分离和检测。
流式细胞仪的测量区利用样品流和鞘流的气压差的层流原理，使细胞依次排列成单行，每个细胞以均等的时间依次通过测量区。
被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照射后发出荧光，同时产生散射光。
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一造血干细胞分离
（一）小鼠骨髓采集与单个核细胞悬液的制备
1 HES(羟乙基淀粉)沉淀法
抽取髓液500 m L按4∶1比例加入HES，自然沉降红细胞后，分离上清。
4℃400 g离心10 min 得细胞沉淀物，以1 %白蛋白盐水液洗涤细胞2次。
2 percoll液密度梯度离心法
①按体积比为～2)∶1在骨髓液中加入淋巴细胞分离液。
4℃,1 5 00 r / min，离心20 min。
取单个核细胞层，以1%白蛋白盐水液洗涤3次。
②取鼠股骨和胫骨 , 在两头关节处切开骨骼 , 反复用培养基冲洗骨髓腔 , 随后小心地逐滴将细胞悬液加在淋巴细胞分离液上 , 2 000 r / min 离心 20 min。
吸取离心后相交液面处的白色细胞层即为单个核细胞。
3 Ficoll分离法
方法一在15ml分离管中加比重为的Ficoll液，缓慢移入等量骨髓细胞悬液，整体平衡后低温离心2000r/min×20min,吸取白细胞层，用RPMI1640液亲清洗后离心2000r/min×10min,取白细胞层加RPMI1640液到10ml制成造血干细胞悬液样本。
方法二取无菌离心管1支，预先添加3mlFicoll(与骨髓细胞悬液体积1:1)，用滴管取单细胞悬液3ml，沿离心管壁小心缓慢叠加于分离液面上，注意保持清楚的界面，室温下水平离心2000rpm×20分钟，（后续在冰上进行）用毛细吸管插到云雾层，小心吸取单个核细胞，置入另一短中管中，加入5倍以上体积的磷酸缓冲液PBS，1500rpm×10分钟，L-DMEM洗涤细胞两次，每次以1000r/min 离心10min，去上清液。
（除第一步的室温离心外，其余为低温离心）。
取骨髓细胞悬液的方法是：取出大鼠腿骨将肌肉尽可能剔除，并用PBS缓冲液冲洗干净。
在超净台中腿骨浸泡在PBS缓冲液中5min，之后在两头关节处切开骨骼 , 反复用PBS缓冲液冲洗骨髓腔，从而得到骨髓细胞悬液。
（二）Linc-- kit+造血干细胞的分离纯化。
去除 Lin+细胞( 负筛选) : 带有生物素的混合抗体标记成熟细胞 ; 抗生物素的磁珠吸附抗体标记的成熟细胞 , 包括 T , B淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞以及它们的定向前体细胞 ; 细胞通过磁场不被柱子吸附的包括造血干细胞和骨髓间质干细胞。
收集CD117+细胞( 正筛选)：带有CD117抗体的磁珠吸附CD117+细胞 , 细胞通过磁场被柱子吸附的CD117+细胞(具体操作步骤参照M iltenyi公司MACS手册)。
（三）根据细胞表面CD34+抗原进行分离纯化
流式细胞仪检测骨髓CD34+细胞：取50μL细胞悬液 , 加入μL CD45- FITC和10μL CD34- PE 充分混合 , 避光孵育15 min。
以PBS液洗涤并加多聚甲醛固定液450μL固定 , 上机检测。
磁性标记 CD34+细胞：在细胞悬液中加入100μL Fc - R阻滞剂 , 再加入100μLCD34 磁珠标记细胞 , 于4℃冰箱中充分混合孵育 30 min。
用PBS 缓冲液洗涤细胞，离心10 min , 去上清液后再以500μL PBS缓冲液重新悬浮细胞。
MiniMACS磁性分离、纯化CD34+细胞：将MS分离柱放置在MACS分离器的磁场中，以500μL PBS 缓冲液漂洗。
以孔径30μm的尼龙网或过滤器去除细胞悬液凝块 , 细胞通过分离柱 , 以500μL PBS
缓冲液冲洗 3次。
将分离柱从分离器中移出并放置在合适的试管中 , 于分离柱顶端滴注P BS 缓冲液 1 m L, 用分离柱配备的活塞加压将保留的细胞冲出。
重复磁性分离步骤，将洗脱的细胞移至一个新的漂洗过的MS分离柱洗涤，用500μL PBS 缓冲液洗脱保留的细胞。
二造血干细胞培养
1 粒-巨噬细胞集落生成单位(GFU-GM)培养（CD34+细胞的培养）
采用甲基纤维半固体培养基体系进行集落培养。
培养体系中含有50μg / L重组干细胞生长因子( rhSCF)、10μg / Lrh GM-CSF、10μg / L重组白细胞介素( rhIL) -3。
在1 mL培养体系中加入1×105个有细胞。
5 %CO2 , 37℃条件下培养14 d , 倒置显微镜下计数CFU-GM集落数。
2 MNCs与HSCs的体外培养
（1）MNCs体外培养：用含10 %小牛血清的高糖DMEM培养基培养 , MNCs以5×104个/ mL接种于24孔板中，每孔1 mL；(2)HSCs体外培养：用无血清高糖DMEM培养基，HSCs以1×104个/ mL 接种于24孔板中。
细胞均置37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养。
3 由MNC制备基质细胞层
取新鲜分离的单个核细胞1×106培养于1ml含10%胎牛血清的IMDM中,置于24孔培
养板中,于5%CO2,37℃饱和湿度的CO2孵育箱中,每7天半量换液1次,3周后培养孔底
铺满了基质细胞,去除悬浮细胞,用PBS洗2遍后,用含有EDTA的胰蛋白酶消化,1500RD
照射后将1x104/ml基质细胞移种于24孔板中,每孔1ml,继续培养2天备用。
4 由CD34+细胞制备基质细胞层
取新鲜分离的脐血CD34+细胞1x105培养于1ml无血清培养液(SCGM)中，加入细胞因子
FL+TPo+GM-IL-1+IL-6，细胞因子浓度为FL50ng/ml，TPO50ng/ml，GM一CSF、IL-1
和IL-6分别为10ng/ml，置于24孔培养板中，于5%CO2，37℃饱和湿度的CO2孵育箱中,
每7天半量换液1次，3周后培养孔底铺满了基质细胞，去除悬浮细胞，用PBS洗2遍后,
用含有EDTA的胰蛋白酶消化，1500拉德照射后将1xl了/ml基质细胞移种于24孔板中，
每孔1ml，继续培养2天备用。