间充质干细胞分离及培养方案

脐带间充质干细胞培养操作细则

脐带间充质干细胞分离培养操作细则一、样本接收1.观察运输箱的温度是否符合要求，采集瓶有无渗漏。

2.查看客户信息是否与交接表一致。

3.样本采集瓶外表面喷酒精擦拭消毒，并粘贴样本编码，填写样本接收记录，传入洁净区准备制备。

二、脐带间充质干细胞分离与接种1）准备耗材试剂：10cm培养皿、15ml离心管、50ml离心管、离心管架、10ml 移液管、T75培养瓶、离心管架、无尘布、50ml注射器针头、封口膜、灭菌止血钳、灭菌镊子、灭菌剪刀、废液缸、无血清干细胞培养基（常温复温）、生理盐水、75%酒精（已过滤）。

2）仪器设备准备及预热：电动移液枪、生物安全柜、离心机3）将75%酒精喷到台面，用无尘布擦拭台面，包括侧面及玻璃。

4）将生物安全柜开紫外30min通风10min，样本喷酒精擦拭，放入生物安全柜中，电动移液枪、移液管、离心管、离心管架喷酒精擦拭放入生物安全柜中，无菌棉球放入到广口瓶中加75%酒精放入生物安全柜中。

50ml、15ml离心管放到离心管架上，10cm皿5-7个。

将装有灭菌器械的灭菌盒喷酒精擦拭放入生物安全柜中。

5）取5个10cm皿依次摆开，1，2，4，5号皿依次加入适量的生理盐水，3号皿加入适量的已过滤的75%酒精。

拿出灭菌盒中已灭菌的止血钳，将脐带从保存瓶中取出放到第一个皿里，并取适量样本保存液留样送检支原体。

使用两个止血钳将脐带在第一个皿里清洗尽量去除脐带外表面的血污以及动静脉的血液和血凝块，将脐带转移至2号皿中，同样的方法再次清洗一次并测量其长度。

6）将清洗干净的脐带转移到装有已过滤75%酒精的3号皿中浸泡1min左右（不要超过两分钟），计时结束后，将脐带转移至4号皿中，同样的洗涤方法去除酒精。

清洗结束后将脐带剪成1-2cm短节，放入5号皿中，再次洗涤尽量去除血管内的血污。

再次拿两个10cm皿，加入适量的生理盐水，去一皿的盖子加少许盐水湿润底部及可。

7）将1-2cm的脐带小段转移到新的皿里，用带齿口的镊子取一段脐带，将脐带展开，再按血管走势剔除脐带的两条动脉，一条静脉。

脂肪间充质干细胞提取方法

脂肪间充质干细胞提取方法脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs）是一种广泛存在于人体脂肪组织中的多潜能干细胞。

由于其易于获取、丰富来源以及多向分化潜能等优势，ADMSCs在再生医学和组织工程领域备受关注。

提取脂肪间充质干细胞的方法有多种，常用的包括机械消化法、酶消化法以及分离培养法。

本文将对这些方法进行介绍和比较。

1. 机械消化法机械消化法是一种较为简单直接的提取脂肪间充质干细胞的方法。

首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。

然后，使用机械切割或研磨的方法将脂肪组织分解成小块。

接下来，使用胶原酶等酶类物质对脂肪组织进行消化。

最后，通过离心等方法将脂肪间充质干细胞与其他细胞分离开来。

2. 酶消化法酶消化法是一种常用的提取脂肪间充质干细胞的方法。

首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。

然后，使用胰蛋白酶等酶类物质对脂肪组织进行消化。

消化过程中，酶能溶解脂肪细胞膜，并释放出脂肪间充质干细胞。

最后，通过离心等方法将脂肪间充质干细胞与其他细胞分离开来。

3. 分离培养法分离培养法是一种较为复杂但效果较好的提取脂肪间充质干细胞的方法。

首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。

然后，将脂肪组织切成小块，并加入胶原酶等酶类物质进行消化。

消化后，将细胞悬液进行离心分离，得到含有脂肪间充质干细胞的细胞沉淀。

接下来，将细胞沉淀进行过滤和洗涤，去除其他细胞和残留酶类物质。

最后，将脂肪间充质干细胞进行培养，促进其增殖和分化。

以上提取方法各有优劣。

机械消化法操作简单，但提取效率较低，且存在细胞破损的风险；酶消化法提取效率较高，但对酶的质量和浓度要求较高，且酶消化过程可能影响细胞活力；分离培养法提取效率较高，且可以得到纯度较高的脂肪间充质干细胞，但操作复杂且耗时较长。

为了获得高质量的脂肪间充质干细胞，提取过程中的无菌操作非常重要。

人脐带间充质干细胞操作规范

人脐带间充质干细胞操作规范一、人脐带间充质干细胞的分离和培养1.准备4~5个培养皿，打开放在超净台中，将消毒过的平剪×1，弯剪×2，有齿镊子×4，放入超净台，紫外照射30 min，通风10 XXX;2.在1#、3#和4#号培养皿倒入25 ml生理盐水，在2#培养皿倒入25 ml酒精;3.将盛放脐带的器皿用酒精消毒外表面后放入超净台，用弯嘴钳取出脐带放入1#培养皿，清洗残留血渍，用第2把弯嘴钳配合挤出脐带血管内的积血。

4.将脐带转移至2#培养皿，完全浸泡，计时1 XXX;5.将脐带转移至3#培养皿，用平剪剪成3 cm左右的小段，清洗脐带内的积血(如果积血较多，可再次转入另一加盐水的培养皿);6.用有齿镊子分离2根动脉和1根静脉，剥离华尔通氏胶，放入4#培养皿。

7.将剥离的胶体转移至50 ml离心管中，2000 rpm离心5 min。

8.弃上清液，将胶体倒入干净的培养皿中，用小剪刀将其剪成糊状并转移至50 ml离心管中;9.以0.5 ml/瓶的量将胶体构造块接种至T75培养瓶，每瓶插手4 ml脐带有血清培养液(DMEM/F12 + 10% FBS + 1% L-Glutamine + 1% MEM NEAA + 10 ng/mlbFGF)，水平摇晃培养瓶使组织块分布均匀;10.第2天观察是否有污染，每3天换一次液，并观察细胞爬出情况(过程中须注意平稳地拿放培养瓶，避免组织块发生移动);11.培养14天左右，倒去上清培养液，加心理盐水(3 ml/瓶)洗濯，用0.25%胰酶(2 ml/瓶)消化下爬出细胞及构造块，并用上清培养液(1 ml/瓶)终止消化;12.收集细胞及组织块悬液，2000 rpm离心5 min;13.弃上清液，插手适当心理盐水混匀，用70 μm滤网过滤去除构造块，即得到P0代脐带间充质干细胞;614.细胞计数，按10/瓶接种，每瓶插手10 ml脐带无血清培养液UltraCULTURE + 2% XXX 1% Glutamine + 1% MEM NAA)，每3天换一次液。

羊膜间充质干细胞原代分离培养标准操作规程

1 目的为规范人羊膜来源间充质干细胞原代分离培养的标准操作，特制订本规程。

2范围适用于酶消化法分离培养人羊膜来源间充质干细胞的生产工艺流程。

3职责技术人员负责实施本规程，质量控制人员负责监督技术人员的实际操作和相关记录。

4工作程序4.1 材料健康胎盘羊膜组织4.2仪器设备超净工作台、倒置显微镜、CO2培养箱、电动移液枪、手动移液枪、离心机、37℃恒温气浴摇床、Countstar计数仪、计时器。

4.3试剂耗材4.3.1试剂完全培养基（高糖DMEM培养基+10% FBS+1%NEAA）、1ug/mL EGF、PBS缓冲液、0.5%I 型胶原酶、胰蛋白酶（0.25%胰酶+0.02%EDTA）、75%酒精、95%酒精、0.4%台盼蓝。

4.3.2耗材50mL离心管及离心管架、15mL离心管及离心管架、一次性移液管（2mL、10 mL、25 mL）、巴氏吸管、EP管及EP管架、10cm培养皿、移液枪头（10uL、200uL、1000uL)、镊罐、酒棉罐、酒精灯、酒精喷壶、打火机、无菌纱布无菌、250mL一次性储液瓶。

4.3.3器具4.3.3.1羊膜制作包1（1个肾形盘，2把18cm平镊、2把16cm止血钳、2把16cm组织镊、2 把12.5cm眼科剪、2把16cm弯剪、2把16cm直剪）。

4.3.3.2羊膜制作包2（2把18cm平镊、2把16cm直剪、2把16cm组织镊）4.3.3.3无菌100ml烧杯、、无菌15cm玻璃培养皿、无菌粗漏、无菌100目筛网、无菌废液杯、无菌不锈钢方盘。

4.4操作步骤4.4.1入洁净区之前用抑菌洗手液洗手，用75%酒精擦拭消毒双手，按照规定穿洁净服、戴口罩、戴帽子和手套。

4.4.2开恒温气浴摇床预热，打开超净台紫外灯消毒30min。

同时将实验所需培养基、0. 5%I 型胶原酶、胰蛋白酶、PBS缓冲液放置室温。

4.4.3 关紫外灯，打开通风10min，用无菌纱布单向擦拭消毒超净台，点燃酒精灯。

原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法

原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，广泛应用于组织工程、再生医学等领域。

原代骨髓间充质干细胞的分离和提取是进行相关研究的基础。

本文将详细介绍原代骨髓间充质干细胞的分离及提取方法。

一、实验材料1.骨髓样本：取自健康志愿者或实验动物（如大鼠、小鼠等）。

2.PBS缓冲液：磷酸盐缓冲液，用于细胞洗涤和分离。

3.胎牛血清：用于细胞培养。

4.抗生素：如青霉素和链霉素，用于细胞培养液中，防止细菌感染。

5.细胞分离液：如Ficoll分离液、Percoll分离液等。

6.细胞培养瓶、离心管、移液器等实验室常用器材。

二、分离方法1.骨髓样本采集：在无菌条件下，从志愿者或实验动物体内抽取骨髓，置于含有抗凝剂的离心管中。

2.骨髓细胞分离：将骨髓样本用PBS缓冲液稀释，然后缓慢加入细胞分离液，进行密度梯度离心。

离心后，收集界面层的细胞，即含有骨髓间充质干细胞的一层。

3.细胞洗涤：用PBS缓冲液洗涤细胞，去除残留的分离液和红细胞。

4.细胞计数：用细胞计数板对洗涤后的细胞进行计数，调整细胞浓度为合适的值。

5.细胞接种：将细胞接种于含有胎牛血清和抗生素的细胞培养液中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。

三、提取方法1.原代培养：将分离得到的骨髓间充质干细胞进行原代培养，待细胞生长至80%-90%汇合时，进行传代。

2.传代培养：将原代细胞用胰蛋白酶消化，然后按照1:2或1:3的比例进行传代。

传代后的细胞继续培养至所需细胞量。

3.细胞冻存：将提取得到的骨髓间充质干细胞进行冻存，以备后续实验使用。

4.细胞复苏：将冻存的细胞在37℃水浴中快速融化，然后用细胞培养液重悬，继续培养。

四、注意事项1.在实验过程中，严格遵循无菌操作原则，防止细胞污染。

2.骨髓样本的采集和处理应在抗凝条件下进行，以保持细胞活性。

3.选择合适的细胞分离液和离心条件，以提高骨髓间充质干细胞的分离纯度。

大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)的分离、鉴定与培养

大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的分离与鉴定大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的分离与鉴定材料试剂(一)主要设备和产地1.手术器械上海手术器械厂2.台式水平离心机Eppendorf，5810R德国3.Nanopure超纯水仪日本SANYO公司4.AA一200型电子天平美国Denver Instrumol/Lent公司5.低温高速离心机ThermoForma公司6.90一2型磁力搅拌器上海沪西分析仪器厂7.电动匀速垂直转轮上海沪西分析仪器厂8.微量移液枪德国Eppendorf公司9.烧杯、容量瓶上海实生公司10.全自动酶标光度仪美国Bio-Rad公司11.6cm/10cm细胞培养皿美国Conring12.2mL冻存管、细胞冷冻储存器美国Conring13.低温高速离心机ThermoForma公司产品14.YJ-875超净工作台苏州工业园区三兴净化科技有限公司15.C02培养箱3111型美国Thermo Forma公司16.CK40-F200型倒置显微镜日本Olympus公司17.10ml注射器美国BD公司(二)试剂和材料1.谷氨酰胺(L-Glutamine)美国Hyclone公司2.75%消毒酒精上海生工3.肝素美国sigma公司4.胰蛋白酶美国Amresco公司5.胎牛血清美国Gibco公司6.α-MEM培养液美国Hyclone公司7.5-6周龄SD大鼠上海斯莱克实验动物有限公司8.Percoll细胞分离液美国GE公司9.DMSO(细胞培养级)美国Sigma公司Rat BMSC的分离与培养分离颈椎脱臼法处死大鼠，75%酒精中浸泡5分钟，超级工作台内依次取下大鼠两条胫骨及两条股骨。

用手术器械将长骨上附着的肌肉组织尽量去除干净，整个过程保持无菌。

用剪刀剪去长骨两端，10ml注射器吸取加入肝素的完全培养液（10%FBSα-MEM），从长骨一端开口处注入，将骨髓腔内的细胞出入到50ml离心管内，直至长骨冲洗的发白，认为骨髓腔内的细胞都被吹入离心管内。

骨髓间充质干细胞培养方法大全

一、四种方法简介及优缺点：骨髓间充质干细胞主要有4种体外分离方法：贴壁筛选法，密度梯度离心法，流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法。

贴壁筛选法是利用细胞贴壁时间及贴壁牢固性的不同逐步将非贴壁细胞和其它杂质细胞去除的一种简单易行的培养MSCS的方法。

贴壁分离培养法分离的MSCS能在体外培养条件下生长良好、可连续传代，体外培养扩增能力较强，其缺点是细胞纯度较低。

此方法简便，冲出骨髓直接培养，然后利用骨髓MSCS 贴壁生长特性，更换培养液逐步去处漂浮生长的造血系细胞即可获得较纯化的MSCS；而且骨髓中的造血干细胞能分泌生长因子和促贴壁物质，可促进MSCS 贴壁生长，因此全骨髓贴壁法更为可取。

密度梯度离心法梯度离心法的核心主要是基于密度梯度离心技术。

梯度离心法是根据骨髓中细胞成分的比重不同，使用淋巴细胞分离液提取单个核细胞，再进行贴壁培养，从而达到分离、纯化MSCS的目的。

Pittenger等的研究发现通过密度梯度离心分离培养的间充质干细胞在第一代时纯度可以达到95%。

常用的分离方法免疫磁珠法，是利用免疫学的技术分离MSCS，分离细胞的纯度高。

Phinney 用一种免疫耗损技术精确地将造血细胞系和内皮细胞系从基质细胞中分离出来，提供了一种能高效的分离纯化间充质干细胞的方法，但目前仍未筛选到真正特异性的细胞表面标记;而且，这两种分离方法的操作对细胞活性都有较大影响，造成MSCS损伤，出现增殖缓慢等问题，这些技术问题很大程度上限制了这两种方法的应用。

因此，如何能简便高效地获得均质性的间充质干细胞和细胞群仍需要继续探索。

分离细疫磁珠分离和流式细胞仪筛选的方法，不仅对细胞活性影响较大，而且操作复杂，价格昂贵。

然而，这些纯化间充质干细胞的方法比较复杂，一般仅限于在各自的实验室应用。

二、具体实验流程1. 免疫磁珠法分离纯化骨髓间充质干细胞：1 实验动物Sd大鼠2 试剂和仪器BSA、荧光标记小鼠抗体x、PE磁珠试剂盒、抗生物素磁珠、MiniMACS分离器及MS分离柱。

脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定

脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定概述脐带血间充质干细胞（Wharton’s jelly mesenchymal stem cells, WJ-MSCs）是一类来源于脐带的干细胞。

WJ-MSCs具有较强的增殖能力、多向分化潜能、免疫调节功能等，是目前研究领域中备受关注的干细胞类型之一。

在该文档中，我们将介绍如何从脐带血样中分离出WJ-MSCs，并进行相关的细胞培养和鉴定。

分离过程脐带血样获取首先需要从人体获得脐带血样。

脐带血样一般可以在婴儿出生后通过脐带穿刺等方式获取。

获取脐带血样需要得到母亲的同意，并通过相关机构进行规范化处理。

分离WJ-MSCs脐带血样获取后，需要将其中的WJ-MSCs进行分离。

具体分离步骤如下： 1.将脐带血样转移至离心管中； 2. 加入相同体积的PBS，并轻轻混合； 3. 通过低速离心分离脐带血样中的血细胞等成分； 4. 取下沉后的WJ组织，加入胶原酶等酶类消化物进行消化，离心分离细胞； 5. 通过细胞培养等方式扩增细胞数量。

细胞培养在分离得到WJ-MSCs之后，需要进行相关的细胞培养。

具体培养步骤如下：1. 将分离得到的WJ-MSCs转移至新的培养皿中； 2. 加入含有10% FBS的DMEM低糖培养基； 3. 定期更换培养基，并记录生长状况。

鉴定方法确定分离的细胞为WJ-MSCs的方法很多，常用的方法如下： #### 形态学鉴定通过显微镜观察细胞形态、吸附能力等，判断细胞是否符合WJ-MSCs的特征。

免疫学鉴定通过使用针对WJ-MSCs标记的分子抗体（如CD73、CD90等）对细胞进行标记，并使用流式细胞仪等方法进行检测。

活力检测通过MTT法、细胞增殖实验等，检测WJ-MSCs是否具备较强的增殖能力。

多向分化鉴定通过对WJ-MSCs进行分化培养，如脂肪细胞培养、软骨细胞培养等，检测WJ-MSCs是否显示多向分化的潜能。

结论通过脐带血样的分离，可以获得WJ-MSCs，并通过相关的培养和鉴定方法，确定其为WJ-MSCs，并进一步应用于生物医学实验中，具有潜在的临床应用前景。

胎盘间充质干细胞的分离和培养

胎盘间充质干细胞得分离,原代与继代培养及鉴定刘亭2016、7。

21目录前言 (2)1分离制备PMSC组织得选取 (3)2脐带,胎盘MSC得分离与纯化 (5)2、1胎盘组织得获取,存储与清洗 (5)2—2 脐带,胎盘MSC得分离及纯化方法 (6)3 原代培养与继代培养 (10)3-1培养基 (10)3-2培养密度 (11)3—3培养条件 (11)3—4换液 (11)3-5 传代培养 (12)3-6细胞形态与生长速度 (12)3-7 MSC得冻存与复苏: (12)4细胞表面抗原检测 (13)5生长曲线 (13)6细胞周期 (13)7分化潜能 (13)参考文献 (13)附件1不同实验室从脐带血,脐带与胎盘等各组织中分离MSC得方法 (15)脐带血 (15)脐带 (15)羊膜 (17)绒毛膜 (17)蜕膜层 (18)胎盘 (18)整体灌注法 (20)附件2 背景知识 (20)附件3 PMSC实验所需试剂 (20)前言干细胞(Stem cell,SC)就是一种能够自我更新且未分化并可分化成两个或两个以上其它品系得细胞。

在一定得条件下,干细胞能够分化成为多种成熟细胞类型。

按照来源与分化潜能不同,干细胞可分为胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)与成体干细胞(Adult stem cell,ASC)两类。

胚胎干细胞来源于早期得胚泡与胚胎内层得细胞群,并且具有向3个胚层细胞分化得能力。

但就是胚胎干细胞应用时产生得免疫排斥、体内实验中引发肿瘤生成以及所涉及得伦理问题等影响并制约了临床应用。

成体干细胞形成于原肠胚形成后得胎儿与成体组织,早期研究认为,成体干细胞主要分化为其来源组织得细胞类型。

然而,近几年来得很多研究表明,成体干细胞具有能够分化成为除来源以外得其她胚层组织得能力。

间充质干细胞(Mesenchymal stem cell, MSC)又称为基质干细胞,就是属于成体干细胞得一种,最早从骨髓中分离而来、MSC就是由早期中胚层发育而来得非造血成体干细胞,该细胞在体外可以贴壁生长,并呈现梭状。

骨髓间充质干细胞分离培养鉴定方法

骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离培养鉴定方法主要包括以下步骤：**一、分离方法**1. **差速贴壁法**：利用BMSCs与骨髓中其他细胞的贴壁性能差异及酶消化敏感性差异进行分离。

这种方法快速、简单、经济，但细胞纯度可能相对较低。

2. **密度梯度离心法**：基于骨髓中不同细胞的大小和密度差异进行分选。

通过流式细胞术检测，细胞表面抗原表达CD105，CD73和CD90必须≥95%，同时表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α，或CD19和HLA － DＲ必须≤2%。

**二、培养方法**培养BMSCs的难点在于保持细胞活性。

不同种属来源的BMSCs在体外培养扩增方法基本相似，但细微的营养条件、培养环境等差异都将会对细胞性能产生影响。

**三、鉴定方法**1. **细胞形态学观察**：利用组织块贴壁法、酶消化法或其结合来分离MSC，并通过传代培养进行形态学观察。

几乎所有的MSC都是贴壁生长，具有较强的贴壁能力。

MSC多数呈纤维细胞样生长，少量呈梭形或不规则三角形。

2. **表面标志物鉴定**：采用流式细胞仪对MSC的细胞表型进行鉴定。

MSC的表面抗原具有非专一性，可以同时表达间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志，如粘附因子、生长因子和细胞因子受体以及整合素家族等。

MSC的细胞表面标志物鉴定标准为：CD105、CD73和CD90的阳性率≥90%；而CD45、CD34、CD14、CD19和HLA-DR 呈阴性，阳性率≤5%。

综上所述，骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定是一个复杂的过程，涉及多个步骤和专业的技术操作。

在进行这些操作时，需要严格遵守实验规程，确保实验的准确性和安全性。

同时，对实验结果的解读也需要具备一定的专业知识和技能。

一种msc分离培养方法

一种msc分离培养方法
一种MSC（间充质干细胞）分离培养方法是通过贴壁培养法。

以下是具体步骤：
1. 材料准备：培养皿、細胞培养基、胎牛血清或其他血清替代物等。

2. 选择适当的组织来源：MSC可以从骨髓、脐带血、脂肪组织等多种组织来源中获得。

根据需要选择适当的来源。

3. 组织处理：将组织样本在消毒的条件下剪碎并悬浮在适量的培养基中。

可以使用酶消化组织来释放单个细胞。

4. 过滤：将细胞悬浮液通过0.2μm的滤膜过滤，以去除大的细胞残渣和杂质。

5. 细胞接种：将过滤后的细胞悬浮液加入到预先消毒的培养皿中。

在培养皿表面生成单层细胞。

6. 培养条件：将细胞培养在37C的恒温培养箱中，提供适当的湿度和含氧环境。

培养基中添加适当浓度的血清或血清替代物。

7. 细胞观察和维护：每天观察细胞的生长情况。

若细胞达到80%的密度，可进行细胞传代，将细胞分散至新的培养皿中进行进一步扩增培养。

8. 细胞收获：当细胞增长到需要的数量和状态时，可以通过一系列的细胞收获方法，如胶原酶消化、细胞刮取等方式进行细胞收获。

这种贴壁培养法能够获得纯化的MSC群体并且有助于维持MSC的干性和分化潜能。

在分离培养的过程中，需要注意细胞的无菌操作和细胞培养条件的优化，以获取高质量和可靠的MSC细胞群体。

兔骨髓间充质干细胞的分离

3000rpm×30 min离心，小心吸取中间白膜层，DMEM 洗涤2次，接种于含 15%FBS的低糖完全培养基中
二、全骨髓培养法
• 制备细胞悬液同前，将所收集的细胞悬液用200 目滤网过滤, 制备成单细胞悬液,1000rpm×5min 洗涤2 次, 弃上清液, 取沉淀重新悬浮后, 接种于含 15% FBS 的培养液中
兔骨髓间充质干细胞的分离
密度梯度离心法全骨髓培养法
一、密度梯度离心法
超酒精棉球、保鲜膜、打火机、手术包、percoll分离液、培养基、培养瓶等
• 取生后21天新西兰大白兔1只（兰州大学动物房提供），重约0.3kg
水淹法处死后, 放入75% 的酒精内浸泡15 min。无菌条件下取出双侧股骨、胫骨、肱骨，去除附带组织,浸入生理盐水中清洗2次
无菌间内，超净台上，将长骨从中间剪断。此方法优点： 1.可最大量提取出干骺端干细胞（丁香园提示干细胞大量存在于干骺端） 2.操作简便，只需剪开一次
• 以10ml 注射器吸取无血清低糖DMEM 培养液反复冲洗, 以骨头发白为准,4号针头反复抽吸制备成单细胞悬液,装入两离心管中以 1000rpm×5min离心，去除上清， DMEM 重悬，轻铺于等量的密度1.073g/ml Percol 分离液上（5ml:5ml）

小鼠骨髓间充质干细胞培养

小鼠骨髓间充质干细胞培养目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。

密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。

随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。

实验准备：1实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g。

2实验材料与试剂高糖DMEM培养基，胎牛血清，双抗（青霉素钠，链霉素），培养皿，镊子，眼科剪，止血钳，1mL注射器操作步骤1、小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取预冷的培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，冲洗液直接收集在插在冰上的离心管中，1500rpm离心5分钟，弃上清，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液重悬细胞，接种于培养皿中（一只小鼠种一个60mm的培养皿），置于5�2，37℃，培养过夜，吸出上清，用PBS洗两遍，洗掉未贴壁的细胞，加入新鲜的培养液，继续培养。

以后每两天换液1次，并观察细胞形态。

待细胞长至80%-85%时传代（1传2）2、原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。

传代后细胞生长迅速。

采用贴壁培养法可获得足够数量、生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。

骨髓间充质干细胞的分离纯化与鉴定

骨髓间充质干细胞的分离纯化与鉴定骨髓间充质干细胞是一类非常重要的细胞种类，它们具有广泛的应用前景，主要用于组织工程、再生医学和免疫治疗等领域。

然而，要在这些应用中实现骨髓间充质干细胞的有效利用，就必须先进行骨髓间充质干细胞的分离纯化与鉴定，以保证获取的细胞具有较大的纯度和生物活性。

骨髓间充质干细胞的分离纯化骨髓间充质干细胞的分离纯化方法主要包括直接培养法、贴壁法、悬浮式培养法等。

其中，直接培养法是一种直接将骨髓细胞培养在培养皿中的方法，通过贴壁式培养，使不同种类的细胞在培养皿上生长，最终使骨髓间充质干细胞附着在培养皿底部，其他细胞则浮于培养液中，从而达到分离骨髓间充质干细胞的目的。

贴壁法则是利用骨髓间充质干细胞具有较好的贴壁性质，将其分离于不贴壁的其他细胞种类中，一般会在6~8小时内附着于培养皿的底部，形成典型的纤维形状。

悬浮式培养法则是将骨髓间充质干细胞分散在培养液中悬浮生长，并加入一些特定因子，使其在悬浮状态下生长和增殖，最终达到分离目的。

骨髓间充质干细胞的鉴定骨髓间充质干细胞的鉴定是指对所分离的骨髓间充质干细胞进行鉴定和确认。

其主要包括形态学、生物学、遗传学和免疫学等多个方面的检测方法。

形态学方面的检测方法主要是通过显微镜观察骨髓间充质干细胞的形态、生长状态和细胞密度等指标进行判断。

生物学方面的检测方法主要包括蛋白质组学、基因组学、代谢学等多个层面的检测指标，以确定其代谢状态、生长状态、分化能力和功能表达等信息。

骨髓间充质干细胞在临床应用中的应用前景骨髓间充质干细胞广泛应用于组织工程、再生医学和免疫治疗等领域。

其中，在组织工程领域，骨髓间充质干细胞可用于修复或重建骨组织、肌肉组织、软骨组织等，并可通过工程化的方法向特定的细胞类型分化，以进一步提高治疗效果。

在再生医学领域，骨髓间充质干细胞可以通过再生医学的手段，促进身体的再生或再生，重建病变组织或器官等。

在免疫治疗领域，骨髓间充质干细胞可以作为免疫干预剂，通过调节机体免疫状态，对肿瘤、自身免疫性疾病等疾病产生治疗效果。

大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)的分离、鉴定与培养

大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的分离与鉴定大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的分离与鉴定材料试剂(一)主要设备和产地1.手术器械上海手术器械厂2.台式水平离心机Eppendorf，5810R德国3.Nanopure超纯水仪日本SANYO公司4.AA一200型电子天平美国Denver Instrumol/Lent公司5.低温高速离心机ThermoForma公司6.90一2型磁力搅拌器上海沪西分析仪器厂7.电动匀速垂直转轮上海沪西分析仪器厂8.微量移液枪德国Eppendorf公司9.烧杯、容量瓶上海实生公司10.全自动酶标光度仪美国Bio-Rad公司11.6cm/10cm细胞培养皿美国Conring12.2mL冻存管、细胞冷冻储存器美国Conring13.低温高速离心机ThermoForma公司产品14.YJ-875超净工作台苏州工业园区三兴净化科技有限公司15.C02培养箱3111型美国Thermo Forma公司16.CK40-F200型倒置显微镜日本Olympus公司17.10ml注射器美国BD公司(二)试剂和材料1.谷氨酰胺(L-Glutamine)美国Hyclone公司2.75%消毒酒精上海生工3.肝素美国sigma公司4.胰蛋白酶美国Amresco公司5.胎牛血清美国Gibco公司6.α-MEM培养液美国Hyclone公司7.5-6周龄SD大鼠上海斯莱克实验动物有限公司8.Percoll细胞分离液美国GE公司9.DMSO(细胞培养级)美国Sigma公司Rat BMSC的分离与培养分离颈椎脱臼法处死大鼠，75%酒精中浸泡5分钟，超级工作台内依次取下大鼠两条胫骨及两条股骨。

用手术器械将长骨上附着的肌肉组织尽量去除干净，整个过程保持无菌。

用剪刀剪去长骨两端，10ml注射器吸取加入肝素的完全培养液（10%FBSα-MEM），从长骨一端开口处注入，将骨髓腔内的细胞出入到50ml离心管内，直至长骨冲洗的发白，认为骨髓腔内的细胞都被吹入离心管内。

绵羊脐带间充质干细胞的分离、体外培养及诱导分化

绵羊脐带问充质干细胞的分离、外培养及诱导分化体
邵伟秦小惠，再丽，古，况玲余，雄
８０５）３０２（．疆农业大学草食动物营养实验室，鲁木齐１新乌摘８０５；２新疆农业大学动物医学学院，３０２．乌鲁木齐
新疆农业大学学报２１，５４：７￣２１０２３（）２８８
ＪｕｎｌｆＸｉｊａｇＡｇｉｕｔｒｌＵｉｅｓｔｏｒａｎｉｎｒｃｌｕａｎｖｒｉｙｏ
文章编号：１０ — ６４２１）４０７— ４０７８１（０２０ —２８０
Ｉｏａｉｎ．ｌｉａｉｎｉｔｏａｄＩｄｃｉｅｓｌｔｏＣｕｔｖｔｏｎＶｉｒｎｎｕｔｖ
ＤｉｆｒｎｉｔｏｆＳｅｆｅｅｔａｉｎｏｈｅｐＵｍｂｌｃｌＭｅｅｃｙａｔｍｌｓｉｉａｓｎｈｍｌＳｅＣｅｌ
Ｃｉａ．ｏｌｇｆＡｎｍａＭｅｉａＳｉｎｅＸｉａｇＡｇｉｕｔｒｌｉｅｓｔ，ｕｉ３０２，ｈｎ）ｈｎ；２Ｃｌｅｏｉｌｄｃｌｃｃ，￣ｉｎｒｃｌａｖｒｉＵｒｍｑ０５ＣｉａｅｅｕＵｎｙ８ＡｂｔａｔＴｈｂｅｔｅｏｈｓｐｐｒｗａｏｉｏａｅｉｉｏｐｒｆｎｕｔｖｔｈｅｍｂｌａｓｎｓｒｃ：ｅｏｊｃｉｆｔｉａｅｓｔｓｌｔｎｖｔ，ｕｉｙａｄｃｌａｅｓｅｐｕｉｃｌｍｅｅｖｒｉｉ

一种药用级间充质干细胞及其培养方法

一种药用级间充质干细胞及其培养方法《一种药用级间充质干细胞及其培养方法》嘿，宝子们！今天我就像个怀揣着绝世秘籍的大侠一样，来给你们唠唠这个药用级间充质干细胞及其培养方法。

这可就像是培育超级小战士一样，特别有趣呢！首先呢，咱们得先有细胞的来源。

这就好比你要组建一支军队，得先找到合适的兵源。

间充质干细胞可以从好多地方来，比如说骨髓啦，脂肪组织啦。

我可跟你们说啊，就像我之前有一次，想从骨髓里取细胞，那感觉就像是在挖掘宝藏一样。

骨髓可是个好地方，里面藏着好多能成为“超级战士”的细胞种子呢。

不过取的时候可得小心点，就像你在挖宝藏的时候，不能把宝藏盒子给弄坏了。

这个过程要在非常严格的医疗环境下进行哦，就像超级特工执行任务，容不得一点马虎。

拿到细胞源之后呢，咱们就要开始分离细胞了。

这一步就像是把混在一起的各种小豆子分开，只留下咱们想要的那种豆子。

要用专门的试剂，就像魔法药水一样，把间充质干细胞从其他细胞里分离出来。

我记得我刚开始做的时候，看着那些试剂滴进细胞溶液里，就像看着魔法在施展，心里紧张得很，想着可千万别把我的“小战士”给变没了。

这个步骤要特别注意试剂的量，多了少了都不行，就像做菜放盐，多了太咸，少了没味。

接下来就是培养的环境了。

这就像是给咱们的“小战士”盖房子，要给他们一个舒服的家才能茁壮成长。

培养皿就是他们的小家啦，里面要放上特制的培养液。

这个培养液啊，那可是细胞的“营养大餐”，里面各种营养成分就像各种美味菜肴一样。

我有时候就想，这些细胞吃着这么好的“饭菜”，肯定能长得壮壮的。

温度也很重要，要保持在一个很合适的温度，就像咱们人住在房子里，温度得适宜，不能太热也不能太冷，不然细胞就像咱们人一样会生病的，那可就麻烦了。

然后就是细胞的传代培养啦。

当细胞在“小家”里住得满满当当的时候，就像房子住不下了，咱们就得给它们换个更大的房子。

这个时候要把细胞按照一定的比例分到新的培养皿里，这比例可得算好了，就像分蛋糕一样，每个人都得有合适的份额。

胎盘间充质干细胞的分离和培养

胎盘间充质干细胞的分离和培养胎盘间充质干细胞的分离，原代与继代培养及鉴定刘亭2016.7.21目录前言 (2)1分离制备PMSC组织的选取 (4)2脐带，胎盘MSC的分离与纯化 (7)2.1胎盘组织的获取，存储与清洗 (7)2-2 脐带，胎盘MSC的分离及纯化方法 (8)3 原代培养和继代培养 (13)3-1培养基 (13)3-2培养密度 (14)3-3培养条件 (15)3-4换液 (15)3-5 传代培养 (16)3-6细胞形态与生长速度 (16)3-7 MSC的冻存与复苏： (16)4细胞表面抗原检测 (17)5生长曲线 (17)6细胞周期 (17)7分化潜能 (17)参考文献 (17)附件1不同实验室从脐带血，脐带和胎盘等各组织中分离MSC的方法 (19)脐带血 (19)脐带 (20)羊膜 (22)绒毛膜 (23)蜕膜层 (24)胎盘 (24)整体灌注法 (26)附件2 背景知识 (27)附件3 PMSC实验所需试剂 (27)前言干细胞（Stem cell，SC）是一种能够自我更新且未分化并可分化成两个或两个以上其它品系的细胞。

在一定的条件下，干细胞能够分化成为多种成熟细胞类型。

按照来源和分化潜能不同，干细胞可分为胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESC）和成体干细胞（Adult stem cell，ASC）两类。

胚胎干细胞来源于早期的胚泡和胚胎内层的细胞群，并且具有向3个胚层细胞分化的能力。

但是胚胎干细胞应用时产生的免疫排斥、体内实验中引发肿瘤生成以及所涉及的伦理问题等影响并制约了临床应用。

成体干细胞形成于原肠胚形成后的胎儿和成体组织，早期研究认为，成体干细胞主要分化为其来源组织的细胞类型。

然而，近几年来的很多研究表明，成体干细胞具有能够分化成为除来源以外的其他胚层组织的能力。

间充质干细胞（Mesenchymal stem cell, MSC）又称为基质干细胞，是属于成体干细胞的一种，最早从骨髓中分离而来。