间充质干细胞(MSCs)的分离方法研究
干细胞提取实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在从骨髓中提取间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs），并对其进行初步鉴定，为进一步的实验研究提供细胞来源。
二、实验材料1. 大鼠骨髓：购自动物实验中心，新鲜取材。
2. DMEM/F12培养基：购自Gibco公司。
3. 胎牛血清（FBS）：购自Gibco公司。
4. 0.25%胰蛋白酶：购自Gibco公司。
5. 抗CD29、CD34、CD45抗体：购自BD公司。
6. 流式细胞仪：购自BD公司。
7. 其他试剂：磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、PBS含2%FBS、4%多聚甲醛等。
三、实验方法1. 骨髓采集：将大鼠麻醉后，无菌操作下取出髌骨，用剪刀剪成小块，置于含有PBS的离心管中，充分漂洗后，用镊子将骨髓组织分离出来。
2. 骨髓细胞消化：将分离出的骨髓细胞用PBS洗涤2次，加入0.25%胰蛋白酶消化5分钟，再用PBS终止消化。
3. 骨髓细胞计数：将消化后的细胞用PBS洗涤2次，调整细胞浓度至1×10^6个/mL。
4. 骨髓细胞培养：将骨髓细胞接种于DMEM/F12培养基中，添加10%FBS，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。
5. 细胞传代：当细胞贴壁生长至80%左右时，用0.25%胰蛋白酶消化，传代至新的培养瓶中。
6. 细胞鉴定：取第3代细胞，用抗CD29、CD34、CD45抗体进行流式细胞仪检测，分析细胞表型。
四、实验结果1. 骨髓细胞在培养箱中贴壁生长，形态呈梭形。
2. 流式细胞仪检测结果显示，骨髓细胞表达CD29、CD34，不表达CD45。
3. 骨髓细胞表现出典型的间充质干细胞表型。
五、实验结论本实验成功从大鼠骨髓中提取了间充质干细胞，并通过流式细胞仪检测验证了其表型。
这为后续的实验研究提供了可靠的细胞来源。
六、实验讨论1. 骨髓是MSCs的重要来源之一，具有来源丰富、易于获取等优点。
2. 本实验采用胰蛋白酶消化法分离骨髓细胞，操作简便，细胞活力较高。
脂肪间充质干细胞提取方法
脂肪间充质干细胞提取方法脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs）是一种广泛存在于人体脂肪组织中的多潜能干细胞。
由于其易于获取、丰富来源以及多向分化潜能等优势，ADMSCs在再生医学和组织工程领域备受关注。
提取脂肪间充质干细胞的方法有多种，常用的包括机械消化法、酶消化法以及分离培养法。
本文将对这些方法进行介绍和比较。
1. 机械消化法机械消化法是一种较为简单直接的提取脂肪间充质干细胞的方法。
首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。
然后，使用机械切割或研磨的方法将脂肪组织分解成小块。
接下来，使用胶原酶等酶类物质对脂肪组织进行消化。
最后，通过离心等方法将脂肪间充质干细胞与其他细胞分离开来。
2. 酶消化法酶消化法是一种常用的提取脂肪间充质干细胞的方法。
首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。
然后，使用胰蛋白酶等酶类物质对脂肪组织进行消化。
消化过程中，酶能溶解脂肪细胞膜，并释放出脂肪间充质干细胞。
最后，通过离心等方法将脂肪间充质干细胞与其他细胞分离开来。
3. 分离培养法分离培养法是一种较为复杂但效果较好的提取脂肪间充质干细胞的方法。
首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。
然后，将脂肪组织切成小块，并加入胶原酶等酶类物质进行消化。
消化后，将细胞悬液进行离心分离，得到含有脂肪间充质干细胞的细胞沉淀。
接下来，将细胞沉淀进行过滤和洗涤，去除其他细胞和残留酶类物质。
最后，将脂肪间充质干细胞进行培养，促进其增殖和分化。
以上提取方法各有优劣。
机械消化法操作简单，但提取效率较低，且存在细胞破损的风险；酶消化法提取效率较高，但对酶的质量和浓度要求较高，且酶消化过程可能影响细胞活力；分离培养法提取效率较高，且可以得到纯度较高的脂肪间充质干细胞，但操作复杂且耗时较长。
为了获得高质量的脂肪间充质干细胞，提取过程中的无菌操作非常重要。
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【摘要】目的探讨分离、培养、纯化和鉴定小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)方法,观察MSCs体外生长特征.方法取小鼠胫骨和股骨,取出骨髓细胞,用1.073 g/ml的Percoll分离液梯度离心,培养皿培养、换液除去非贴壁细胞,获得MSCs,通过传代对MSCs进行纯化和扩增培养.进行形态学观察,测定生长曲线,用流式细胞仪检测P3代MSCs细胞周期及表面抗原.结果新分离的MSCs呈小圆形,形态规整.培养传代后,细胞大小均匀,形态较一致,多为梭形.P1、P2、P3代MSCs生长曲线均呈S型.P3代MSCs 75.27%的细胞处于G0-G1期.P3代MSCs CD44表达阳性,表达率为88.71%,CD34表达阴性.结论利用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离纯化骨髓MSCs,在含15%FBS的DMEM-LG培养基中培养MSCs,可获得稳定生长的昆明小鼠MSCs.培养的MSCs细胞系性状稳定,表型稳定均一,适于做进一步研究.%Objective To explore a new method for the isolation, cultivaton, purification and identification of MSCs and observe the biological features of mice MSCs in vitro. Methods Bone marrow was extracted from the tibia and thighbone of mice. The marrow liquid were isolated with 1. 073 g/ml ocrcoll. MSCs were obtained by removing the non-adherent cells. Then the MSCs were purified and expanded through passage in time. The growth curve was drawn and the morphology was observed. Cell cycle and the antigen expression of P3 MSCs were measured with FACS. Results The MSCs exhibited a small round shape after fresh separation. After cultivated and passaged,the MSCs were homogcnenously fusiform shaped. The growth curves of P1 ,P2 and P3MSCs were "S" shape. The cells of G0-G1 stage account for 75. 27%. The expression of CD 44 was positive, while the expression of CD34 was negative. Conclusion The method of density gradient centrifugation combined with adherent culture could isolate MSCs from bone marrow simplcly. DMEM-LG medium supplemented with 15% fetal bovine scrum is suitable for the culture of MSCs. The cultured MSCs lineage is stable and can be used for further research.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2012(016)001【总页数】3页(P11-13)【关键词】骨髓间充质干细胞;细胞培养;鉴定;小鼠【作者】赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【作者单位】吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院普外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;中日联谊医院【正文语种】中文【中图分类】Q78骨髓间充质干细胞（MSCs）是骨髓中存在的除造血干细胞（HSCs）外的另一类干细胞。
临床研究用人间充质干细胞质量评价
临床研究用人间充质干细胞质量评价一、引言人间充质干细胞（MSCs）由于其多向分化潜能、免疫调节特性以及易于体外培养等特点，被广泛用于临床研究。
在众多疾病的治疗中，MSCs 都展现出了巨大的潜力。
然而，要确保其在临床研究中的有效性，首先需要对MSCs的质量进行严格控制和评价。
本文将探讨如何评价临床研究用MSCs的质量。
二、MSCs的质量评价标准1、细胞的纯度和活性：这是MSCs质量评价的核心指标。
纯度是指MSCs中目标细胞的比例，而活性则是指MSCs的增殖能力和分化能力。
2、细胞的遗传稳定性：通过基因测序等方法，可以检测MSCs是否存在基因突变，以及是否存在潜在的致癌风险。
3、细胞的免疫调节特性：MSCs具有免疫调节特性，可以通过抑制免疫反应来降低排斥反应的风险。
因此，评价MSCs的免疫调节特性也是非常重要的。
4、细胞的来源和生产过程：MSCs的来源和生产过程也会对其质量产生影响。
例如，来自患者的自身MSCs可能比来自捐献者的MSCs更适合用于治疗。
同时，生产过程中的质量控制，如无菌操作、细胞培养基的质量等，也会影响MSCs的质量。
三、MSCs质量评价的方法1、细胞形态观察：通过观察MSCs的形态，可以初步判断其是否具有正常的形态学特征。
2、生长曲线测定：通过绘制MSCs的生长曲线，可以评估其增殖能力。
3、细胞表面标志物检测：通过检测细胞表面标志物，可以确定MSCs 的纯度和活性。
4、染色体核型分析：通过染色体核型分析，可以评估MSCs的遗传稳定性。
5、免疫调节特性检测：通过检测MSCs对免疫反应的调节作用，可以评估其免疫调节特性。
6、生产过程质量控制：通过监控生产过程中的关键控制点，可以确保MSCs的生产过程符合质量标准。
四、结论人间充质干细胞（MSCs）在临床研究中的应用前景广阔，但其质量评价是关键环节。
通过对MSCs的纯度、活性、遗传稳定性、免疫调节特性以及生产过程的质量控制等多方面的评价，可以确保其满足临床研究的需求。
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。
方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞，观察细胞的形态及生长特性，并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。
结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。
传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。
传至10代仍具有良好的增殖活性。
流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45，但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%。
结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。
【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定【中图分类号】R392.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）01-0082-02间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）起源于中胚层，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1]，可分化成骨髓基质支持造血，并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化，同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞，在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节，预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2]，但骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3]，因此，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。
1 材料和方法1.1 材料1.1.1 实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g，购于吴氏动物实验中心。
送检中检验机构间充质干细胞质量标准
送检中检验机构间充质干细胞质量标准引言充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）作为一种多潜能的干细胞，被广泛应用于组织工程、再生医学以及免疫治疗等领域。
由于充质干细胞的质量直接关系到其临床应用的效果和安全性，各个检验机构在进行充质干细胞的质量检验时需要遵循统一的标准。
本文档旨在制定一份统一的充质干细胞质量标准，以确保不同检验机构之间的一致性。
标准内容1. 充质干细胞定义充质干细胞为一类具有自我更新和多向分化潜能的成人软组织起源的凋亡细胞。
2. 充质干细胞分离与培养2.1 分离方法：推荐使用胶原酶及胰酶对组织进行消化分离。
分离过程中需注意细胞的存活率和纯度。
2.2 培养条件：充质干细胞应在适当的培养基中进行培养，包括适宜的营养液、培养基浓度及PH值等。
3. 充质干细胞鉴定3.1 表面标记物：充质干细胞常表达CD73、CD105、CD90，并不表达CD34、CD45和CD11b等表面标记物。
3.2 多向分化潜能：充质干细胞应具备成骨、成脂以及成软骨的分化潜能。
4. 充质干细胞增殖能力充质干细胞应具备较高的增殖能力，通常满足以下条件：- 能够快速扩增至临床所需的细胞数量；- 经带有标记的试剂进行检验，其增殖指数要达到一定的标准。
5. 充质干细胞免疫学特性5.1 免疫抑制作用：充质干细胞应具备对淋巴细胞等免疫细胞的抑制作用。
5.2 免疫抗原性：充质干细胞应具备较低的免疫原性，以减少免疫排斥反应。
结论本文档提供了送检中检验机构间充质干细胞质量标准的基本内容，以确保对充质干细胞的质量检验具有一致性。
各个检验机构应根据实际需求，在此基础上进行进一步的细节制定，以提高充质干细胞的质量控制水平。
在追求高质量代码的同时，本文档已经超过了800字，如需进一步扩展内容或有其他要求，请告知。
人脐带间充质干细胞体外分离、纯化及鉴定
人脐带间充质干细胞体外分离、纯化及鉴定王娟;陆琰;何冬梅;张洹【期刊名称】《暨南大学学报（自然科学与医学版）》【年(卷),期】2009(030)004【摘要】目的:从人脐带中分离、培养并鉴定间充质干细胞(MSCs).方法:用胶原酶消化法分离脐带间充质干细胞,差速贴壁法进行纯化;MTT法检测细胞增殖活性,并绘制生长曲线;流式细胞仪检测其表面标志和细胞周期;地塞米松、抗坏血酸、磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,并用碱性磷酸酶染色鉴定;地塞米松、胰岛素、吲哚美辛诱导其向脂肪细胞分化,用油红O染色鉴定;将脐带MSCs注射到BALB/c裸鼠肾被膜下,观察有无致瘤性.结果:从人脐带中分离出的同充质干细胞为梭形,呈平行排列生长或漩涡状生长;细胞表达CD29、CD44,低表达CD106,不表达CD14、CD31、CD34、CD45和HLA-DR;具有分化成脂肪细胞和成骨细胞的潜能;将脐带MSCs移植到BALB/c裸鼠肾被膜下,未观察到致瘤性.结论:从脐带中成功分离培养的细胞,具有间充质干细胞生物学特性.【总页数】6页(P367-372)【作者】王娟;陆琰;何冬梅;张洹【作者单位】暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632;暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632;暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632;暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632【正文语种】中文【中图分类】Q813【相关文献】1.人成纤维细胞的体外分离、纯化培养及细胞鉴定 [J], 王玲玲;马峰;张玉成;杜珍武;张桂珍2.睾丸Leydig干细胞分离、纯化及鉴定的体外研究 [J], 肖斌;王晓云;周广东;周英晋;毕宏达;朱吉;张敬德;邢新3.大鼠雪旺细胞体外分离培养纯化及鉴定 [J], 张春燕;张自强;刘玉梅;邓雯;王玉琴4.猴头菌素分离纯化、结构鉴定及体外活性研究 [J], 何晋浙;樊鹏;孙培龙5.胎猪胰腺导管干细胞的体外分离、纯化、培养及鉴定 [J], 李云龙;郭欣;杨晓波;黄跃南因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法
原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，广泛应用于组织工程、再生医学等领域。
原代骨髓间充质干细胞的分离和提取是进行相关研究的基础。
本文将详细介绍原代骨髓间充质干细胞的分离及提取方法。
一、实验材料1.骨髓样本：取自健康志愿者或实验动物（如大鼠、小鼠等）。
2.PBS缓冲液：磷酸盐缓冲液，用于细胞洗涤和分离。
3.胎牛血清：用于细胞培养。
4.抗生素：如青霉素和链霉素，用于细胞培养液中，防止细菌感染。
5.细胞分离液：如Ficoll分离液、Percoll分离液等。
6.细胞培养瓶、离心管、移液器等实验室常用器材。
二、分离方法1.骨髓样本采集：在无菌条件下，从志愿者或实验动物体内抽取骨髓，置于含有抗凝剂的离心管中。
2.骨髓细胞分离：将骨髓样本用PBS缓冲液稀释，然后缓慢加入细胞分离液，进行密度梯度离心。
离心后，收集界面层的细胞，即含有骨髓间充质干细胞的一层。
3.细胞洗涤：用PBS缓冲液洗涤细胞，去除残留的分离液和红细胞。
4.细胞计数：用细胞计数板对洗涤后的细胞进行计数，调整细胞浓度为合适的值。
5.细胞接种：将细胞接种于含有胎牛血清和抗生素的细胞培养液中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。
三、提取方法1.原代培养：将分离得到的骨髓间充质干细胞进行原代培养，待细胞生长至80%-90%汇合时，进行传代。
2.传代培养：将原代细胞用胰蛋白酶消化，然后按照1:2或1:3的比例进行传代。
传代后的细胞继续培养至所需细胞量。
3.细胞冻存：将提取得到的骨髓间充质干细胞进行冻存，以备后续实验使用。
4.细胞复苏：将冻存的细胞在37℃水浴中快速融化，然后用细胞培养液重悬，继续培养。
四、注意事项1.在实验过程中，严格遵循无菌操作原则，防止细胞污染。
2.骨髓样本的采集和处理应在抗凝条件下进行，以保持细胞活性。
3.选择合适的细胞分离液和离心条件，以提高骨髓间充质干细胞的分离纯度。
间充质干细胞成脂成骨分化实验方法学开发思路和流程
间充质干细胞成脂成骨分化实验方法学开发思路和流程干细胞是一种具有自我更新能力和多潜能分化的细胞，可以分化成为各种类型的细胞，包括脂肪细胞和骨细胞。
间充质干细胞（MSCs）是一种重要的干细胞类型，它们存在于各种组织中，如骨髓、脂肪组织和胎盘组织等。
间充质干细胞成脂成骨分化的实验方法学开发，是生物医学研究中一个重要的课题。
本文将从方法学开发的思路和流程入手，对间充质干细胞成脂成骨分化实验方法学进行探讨。
一、研究背景间充质干细胞成脂成骨分化是指间充质干细胞在一定的诱导条件下分化为脂肪细胞或骨细胞的过程，这一过程在细胞生物学和再生医学领域具有重要意义。
成脂成骨分化的研究有助于深入了解骨质疏松症、骨折愈合和脂肪代谢等疾病的发病机制，同时也为干细胞治疗提供了理论基础。
因此，开发一套可靠的实验方法学对于间充质干细胞成脂成骨分化研究至关重要。
1.确定分化诱导条件间充质干细胞在体外培养时，可通过添加不同的生长因子、细胞因子或药物来诱导其分化为脂肪细胞或骨细胞。
因此，确定最佳的分化诱导条件是方法学开发的第一步。
此过程需要考虑到诱导因子的种类、浓度、培养时间等因素，以及不同来源的间充质干细胞在分化过程中的差异性。
2.确定评价指标分化过程中，需要通过一系列的生物化学和分子生物学方法来评价间充质干细胞的脂肪细胞或骨细胞特征。
这些评价指标包括脂肪细胞的油红O染色、脂肪球形成实验，以及骨细胞的矿化实验、ALP染色等。
确定合适的评价指标对于评估分化效果至关重要。
3.确定实验方案在确定了分化诱导条件和评价指标后，需要制定详细的实验方案。
包括细胞的处理方法、诱导条件的优化、实验的时间节点等，以便后续实验的顺利进行。
1.间充质干细胞的提取和培养首先需要从适当的组织中分离和提取间充质干细胞，并进行细胞培养。
这一步需要注意细胞的纯度和活性，以保证后续实验的准确性。
2.分化诱导实验将培养好的间充质干细胞分别进行脂肪和骨分化诱导实验，根据预先确定的诱导条件进行处理。
小鼠骨髓间充质干细胞分离培养新方法
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是骨髓中除造血干细胞外另一重要的干细胞。
MSC 具有自我更新、多向分化、免疫调控和支持造血的能力，而且来源广泛，容易在体外培养和扩增，目前已经应用于临床并显示了良好的治疗效果。
虽然MSC临床应用广泛，但许多关键问题如免疫调控的具体机制等并未解决。
小鼠是重要的实验动物之一，广泛用于基础实验研究。
在体外成功分离培养MSC，并得到大量纯化的MSC是研究其分化及功能调控机制的前提。
目前分离小鼠骨髓MSC的方法包括全骨髓贴壁法、骨片消化法、流式或磁珠分选法等。
然而全骨髓贴壁法获得的细胞往往含有不少造血细胞；骨片消化法需要进行胶原酶消化，步骤多且消化时问不好控制；流式或磁珠法虽然获得细胞较纯，但程序复杂，花费高且获得的细胞相对少。
骨髓MSC的分离目前常用的方法有全骨髓贴壁法、骨片消化法和流式细胞术或磁珠分选法。
全骨髓贴壁法即根据MSC的贴壁性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。
然而该方法获得的MSC往往含有较多基质细胞和造血细胞污染。
我们的结果也显示，全骨髓贴壁法原代培养的细胞有75％为CD45阳性的细胞，传至第3代，MSC中仍有5％的CD45阳性细胞，即造血细胞。
骨片消化法，是先将骨髓冲干净，将股骨和胫骨剪碎，然后进行胶原酶消化。
虽然该方法获的MSC纯度较高，但是程序复杂，且不同鼠龄骨片胶原酶消化时间不同，不容易掌握。
随着对MSC表面抗原认识的深入，有研究者利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法对其进行分离纯化旧191；虽然这些方法可以得到纯度较高的细胞，但分离过程对细胞的活性影响较大，甚至导致细胞完全失去活性；而且实验条件要求高，需要骨髓量大，加之耗费较大和技术难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。
本研究采用骨髓加骨片法分离小鼠MSC，即将股骨和胫骨肌肉去干净后，不需冲骨髓，不需消。
脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定
脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定概述脐带血间充质干细胞（Wharton’s jelly mesenchymal stem cells, WJ-MSCs）是一类来源于脐带的干细胞。
WJ-MSCs具有较强的增殖能力、多向分化潜能、免疫调节功能等，是目前研究领域中备受关注的干细胞类型之一。
在该文档中，我们将介绍如何从脐带血样中分离出WJ-MSCs，并进行相关的细胞培养和鉴定。
分离过程脐带血样获取首先需要从人体获得脐带血样。
脐带血样一般可以在婴儿出生后通过脐带穿刺等方式获取。
获取脐带血样需要得到母亲的同意，并通过相关机构进行规范化处理。
分离WJ-MSCs脐带血样获取后，需要将其中的WJ-MSCs进行分离。
具体分离步骤如下： 1.将脐带血样转移至离心管中； 2. 加入相同体积的PBS，并轻轻混合； 3. 通过低速离心分离脐带血样中的血细胞等成分； 4. 取下沉后的WJ组织，加入胶原酶等酶类消化物进行消化，离心分离细胞； 5. 通过细胞培养等方式扩增细胞数量。
细胞培养在分离得到WJ-MSCs之后，需要进行相关的细胞培养。
具体培养步骤如下：1. 将分离得到的WJ-MSCs转移至新的培养皿中； 2. 加入含有10% FBS的DMEM低糖培养基； 3. 定期更换培养基，并记录生长状况。
鉴定方法确定分离的细胞为WJ-MSCs的方法很多，常用的方法如下： #### 形态学鉴定通过显微镜观察细胞形态、吸附能力等，判断细胞是否符合WJ-MSCs的特征。
免疫学鉴定通过使用针对WJ-MSCs标记的分子抗体（如CD73、CD90等）对细胞进行标记，并使用流式细胞仪等方法进行检测。
活力检测通过MTT法、细胞增殖实验等，检测WJ-MSCs是否具备较强的增殖能力。
多向分化鉴定通过对WJ-MSCs进行分化培养，如脂肪细胞培养、软骨细胞培养等，检测WJ-MSCs是否显示多向分化的潜能。
结论通过脐带血样的分离，可以获得WJ-MSCs，并通过相关的培养和鉴定方法，确定其为WJ-MSCs，并进一步应用于生物医学实验中，具有潜在的临床应用前景。
胎盘间充质干细胞的分离和培养
胎盘间充质干细胞的分离和培养胎盘间充质干细胞的分离，原代与继代培养及鉴定刘亭2016.7.21目录前言 (2)1分离制备PMSC组织的选取 (4)2脐带，胎盘MSC的分离与纯化 (7)2.1胎盘组织的获取，存储与清洗 (7)2-2 脐带，胎盘MSC的分离及纯化方法 (8)3 原代培养和继代培养 (13)3-1培养基 (13)3-2培养密度 (14)3-3培养条件 (15)3-4换液 (15)3-5 传代培养 (16)3-6细胞形态与生长速度 (16)3-7 MSC的冻存与复苏： (16)4细胞表面抗原检测 (17)5生长曲线 (17)6细胞周期 (17)7分化潜能 (17)参考文献 (17)附件1不同实验室从脐带血，脐带和胎盘等各组织中分离MSC的方法 (19)脐带血 (19)脐带 (20)羊膜 (22)绒毛膜 (23)蜕膜层 (24)胎盘 (24)整体灌注法 (26)附件2 背景知识 (27)附件3 PMSC实验所需试剂 (27)前言干细胞（Stem cell，SC）是一种能够自我更新且未分化并可分化成两个或两个以上其它品系的细胞。
在一定的条件下，干细胞能够分化成为多种成熟细胞类型。
按照来源和分化潜能不同，干细胞可分为胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESC）和成体干细胞（Adult stem cell，ASC）两类。
胚胎干细胞来源于早期的胚泡和胚胎内层的细胞群，并且具有向3个胚层细胞分化的能力。
但是胚胎干细胞应用时产生的免疫排斥、体内实验中引发肿瘤生成以及所涉及的伦理问题等影响并制约了临床应用。
成体干细胞形成于原肠胚形成后的胎儿和成体组织，早期研究认为，成体干细胞主要分化为其来源组织的细胞类型。
然而，近几年来的很多研究表明，成体干细胞具有能够分化成为除来源以外的其他胚层组织的能力。
间充质干细胞（Mesenchymal stem cell, MSC）又称为基质干细胞，是属于成体干细胞的一种，最早从骨髓中分离而来。
一种msc分离培养方法
一种msc分离培养方法
一种MSC（间充质干细胞）分离培养方法是通过贴壁培养法。
以下是具体步骤：
1. 材料准备：培养皿、細胞培养基、胎牛血清或其他血清替代物等。
2. 选择适当的组织来源：MSC可以从骨髓、脐带血、脂肪组织等多种组织来源中获得。
根据需要选择适当的来源。
3. 组织处理：将组织样本在消毒的条件下剪碎并悬浮在适量的培养基中。
可以使用酶消化组织来释放单个细胞。
4. 过滤：将细胞悬浮液通过0.2μm的滤膜过滤，以去除大的细胞残渣和杂质。
5. 细胞接种：将过滤后的细胞悬浮液加入到预先消毒的培养皿中。
在培养皿表面生成单层细胞。
6. 培养条件：将细胞培养在37C的恒温培养箱中，提供适当的湿度和含氧环境。
培养基中添加适当浓度的血清或血清替代物。
7. 细胞观察和维护：每天观察细胞的生长情况。
若细胞达到80%的密度，可进行细胞传代，将细胞分散至新的培养皿中进行进一步扩增培养。
8. 细胞收获：当细胞增长到需要的数量和状态时，可以通过一系列的细胞收获方法，如胶原酶消化、细胞刮取等方式进行细胞收获。
这种贴壁培养法能够获得纯化的MSC群体并且有助于维持MSC的干性和分化潜能。
在分离培养的过程中，需要注意细胞的无菌操作和细胞培养条件的优化，以获取高质量和可靠的MSC细胞群体。
骨髓间充质干细胞（MSC）的分离，扩增及表型鉴定
骨髓间充质干细胞（MSC）的分离，扩增及表型鉴定间充质干细胞或间充质基质细胞（MSC）是可以从各种来源（包括骨髓，脂肪组织或脐带）分离的体细胞或成体干细胞。
分离的MSC 是表现出位点特异性分化的成纤维细胞样细胞。
MSC可能在体内再生受损或患病的组织，并可能在免疫调节中发挥作用，这为各种临床应用提供了基础。
1:缓冲液准备1.1 PE（PBS+EDTA）缓冲液，用于分离单核细胞用磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.2和2mM EDTA制备溶液。
低温（2–8°C）保存。
▲注意：EDTA可以用其他补充剂代替，例如抗凝柠檬酸葡萄糖配方A（ACD-A）或柠檬酸磷酸葡萄糖（CPD）。
1.2 PBE(PBS+BSA+EDTA)缓冲液，用于分离CD271 +细胞。
准备包含磷酸盐缓冲盐水（PBS）的溶液，用autoMACS®冲洗溶液以1:20的比例稀释MACS®BSA储备溶液，可得到pH 7.2、0.5％的牛血清白蛋白（BSA）和2 mM EDTA。
低温（2-8°C）存放。
▲注意：EDTA可以用其他补充剂代替，例如抗凝柠檬酸葡萄糖配方A（ACD-A）或柠檬酸磷酸葡萄糖（CPD）。
BSA可以用其他蛋白质代替，例如相应的血清白蛋白，相应的血清或胎牛血清（FBS）。
不建议使用含有Ca2 +或Mg2 +的缓冲液或培养基。
2：分选单核细胞2.1梯度密度离心2.2人骨髓单个核细胞(BM MNCs)的制备▲注意：仅使用新鲜骨髓。
避免冷冻和解冻骨髓细胞，并在无菌条件下进行。
1.用针头从髂骨上嵴或胸骨采集骨髓。
2.用缓冲液以7：1的比例稀释抽吸的人骨髓，例：用5mL缓冲液稀释30mL的骨髓，最终体积为35mL。
3. 100µm过滤器过滤，去除骨碎片和细胞团。
（▲注：使用前，先用缓冲液的润洗滤器。
）4.将35ml稀释的细胞悬浮液与15ml的Ficoll-Paque混合于50ml 圆锥形瓶中。
小鼠骨髓间充质干细胞的分离及其诱导定向脂肪细胞分化
小鼠骨髓间充质干细胞的分离及其诱导定向脂肪细胞分化焦嫦亮;张阳德;谢祁阳;潘一峰【期刊名称】《中国康复理论与实践》【年(卷),期】2006(012)008【摘要】目的建立小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离和鉴定方法,稳定和优化骨髓MSCs在体外定向向脂肪细胞分化的适宜诱导条件.方法采取贴壁细胞分离法分离和纯化小鼠骨髓MSCs;选用第5代MSCs分别采用CFU-f培养法和CFU-f集落再克隆生成CFU-f集落法鉴定MSCs的增殖和自我更新能力;利用不同组合的成脂培养基定向诱导MSCs分化为脂肪细胞;利用油红O免疫组化染色鉴定分化后的细胞.结果分离和纯化的小鼠骨髓MSCs呈均匀有序的成纤维母细胞样形态;植入2×103～1×105MSC细胞/皿时,可生成不同比例的纯的CFU-f集落,且数量与种入的细胞数呈良好的线性关系;小型CFU-f集落再克隆生成CFU-f集落的能力较弱,而大型CFU-f集落具有较高的再克隆生成CFU-f集落的能力,再克隆生成CFU-f集落率高达90%,而且1个目的集落可再克隆生成多个CFU-f集落;不同诱导方案均可诱导MSC生成脂肪细胞,而合用地塞米松(DM)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、胰岛素(IS)和消炎痛(ID)时效果最佳,诱导MSC生成脂肪细胞的效率可高达96%以上,且生成的细胞绝大多数为成熟脂肪细胞.结论采取贴壁细胞分离法经过长期传代可得到纯化的小鼠骨髓MSCs,MSCs具有高度增殖、自我更新和定向分化为脂肪细胞的能力;DM、IBMX、IS和ID 4种诱导剂合用可诱导96%以上的该细胞定向分化为成熟脂肪细胞.【总页数】4页(P682-684,中插1)【作者】焦嫦亮;张阳德;谢祁阳;潘一峰【作者单位】海南省干细胞研究所,海南海口市,570102;中南大学生物医学工程研究院,湖南,长沙市,410078;中南大学生物医学工程研究院,湖南,长沙市,410078;海南省干细胞研究所,海南海口市,570102;中南大学湘雅医学院生理学系,湖南,长沙市,410078;中南大学生物医学工程研究院,湖南,长沙市,410078【正文语种】中文【中图分类】Q813.1【相关文献】1.体外定向诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞 [J], 孙伟;胡亮;赵兴;李官成;付炳方;潘颂华2.体外定向诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞向许旺细胞样细胞分化的研究 [J], 周丽娜;崔晓军;苏开鑫;王晓红;蔡雪彦;郭金华;雷林忠3.大鼠骨髓间充质干细胞分化成脂肪细胞的定向诱导 [J], 徐道华;周晨慧;刘钰瑜;许碧莲4.地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、吲哚美辛定向诱导兔骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞的研究 [J], 李雅娜;孙研;张玲;刘旭5.小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离纯化及其定向诱导分化为神经元样细胞 [J], 胡亮;董雅娟;柏学进;马保华;杨恕玲;淡新刚;董方圆;王雪红;李建栋;程明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
MSCs分离培养及定向分化为血管内皮细胞的研究
（ Ｃ ， ＭＮ ） 在含 １％胎牛血清 ＬＤ Ｍ培养基中培养 ， ０ — ＭＥ 并传 代扩增 ＭＳ ｓ选取状态较稳 定的第 ４代 细胞 ， Ｃ； 分别用含 １ ％胎牛血清 和 ２ ０ ％胎牛血清的诱导液 （ 终浓度为 １ ｇ ｍＶ Ｇ 、 ｇ ｍ ｂ Ｇ ０ｎ／ ｌ Ｅ Ｆ２ｎ／ ｌＦ Ｆ的 Ｄ Ｅ Ｍ Ｍ培养
结合贴壁培养法 能有效分离纯化 ＭＳ ｓ就诱 导效果而言 ，％胎牛血清诱 导体系明显好于 １％胎 牛血清 Ｃ； ２ ０
诱导体系 ， 说明低浓 度的胎牛血清更有利于 ＭＳ ｓ Ｃ 向血管 内皮细胞 分化。 【 关键词 】 间充质干细胞 ； 细胞培养 ； 分化 ； 血管 内皮细胞
Ｅｘｐｅ ｉ ｅ ｔ ｔ ｒｍ ｎ ａｌｓｕｄｙ ｏ ａｒ ｏｗ ｅ ｅ ｈｙ ａ ｔｍ ｅ ｌｉｏｌｔｏ ｆｍ ｒ ｍ ｓ ｎｃ ｍ ｌ ｓｅ ｃ ｌ ｓ ａ ｎ，ｃ ｔ ｒ ｎｄ ｄ ｆｅ ｅ ｉａ ｏ ｉ ｏ ｖ ｓ ｕ ａ ｉ ｕｌ ｅ ａ ｉ ｒ ｎｔ ｔ ｎ ｎｔ ａ ｃ ｕ ｉ ｌ ｒ
液） 继续 培 养 ， 于第 ７ １ 用 流 式 细 胞 术 分 析 Ｃ ，的 表 达情 况 ， 疫 组 化 法 观察 Ｆ Ｉ 、４天 Ｄ 免 ＶＩ Ｉ的表 达情 况 。 结
果
密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化 ＭＳ ｓ细胞呈 均一 的成纤维细胞样 ， Ｃ， 流式细胞术分析
密 度 梯 度 离 心
张英 杰 李 玉云
【 要】 目的 建立分离和培养大鼠骨髓源 间充质 干细胞 （ Ｓ ｓ 的方 法及定向分化为血 管内皮 摘 Ｍ Ｃ）
细胞 诱 导 条 件 的 优 化 。 方 法 淋 巴 细 胞 分 离 液 （ 比重 １ ０ ７ｇ ｍ ） 度 梯 度 离 心 法 分 离 单 个 核 细 胞 ．７ ／ １ 密
骨髓间充质干细胞的分离分化及研究进展
骨髓间充质干细胞的分离分化及研究进展摘要：骨髓间充质干细胞是存在于骨髓基质中的非造血系细胞，它们能够分化成中胚层和非中胚层细胞。
骨髓间充质干细胞主要有4种体外分离方法：贴壁筛选法，密度梯度离心法，流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法。
由于骨髓间质干细胞具有多方面的优势,越来越受到人们的关注，研究也越来越深入。
本文从来源、形态、体外分离培养及应用前景几个方面做一综述，为相关研究提供参考。
关键词：骨髓间充质干细胞；分离培养；分化骨髓由造血组织和基质构成，近年的研究表明，在骨髓基质中存有间质干细胞(me5enchyma15temcel15，MSCS)，骨髓原始间充质干细胞是骨髓基质干细胞，对骨髓中的造血干细胞（HSC）不仅有机械支持作用，还能分泌多种生长因子（如IL-6，IL-11，LIF，M-CSF及SCF等）来支持造血，体内外实验已证明它具有多向分化潜能，在一定的诱导条件下MSCS具有向成骨细胞、成软骨细胞、成肌细胞、肌键细胞、脂肪细胞等中胚层细胞分化的能力。
因此它已成为医学界近来研究的热点，但骨髓中MSCS含量很少,每1万～10万个单核细胞中大约有1个MSCS,难以满足实际应用的需要，因此体外分离纯化MSCS,研究其培养特性，获得大量稳定的MSCS具有重要的理论意义和现实意义。
1. 骨髓间质干细胞的来源在生物个体的发育过程中先后出现胚胎干细胞和成体干细胞,具有多向分化潜能的间质干细胞作为一种成体干细胞来源于中胚层间充质,主要存在于全身结缔组织和器官间质中,以骨髓组织中含量最为丰富,在人的骨髓中约占单个核细胞数的1/1×105[1]。
间充质干细胞是一类贴壁基质细胞，可以向间质组织分化，包括骨组织，软骨组织，脂肪组织。
目前研究较多的间质干细胞主要来源于脐带血、外周血及脂肪组织。
MSCS的获得主要来自于骨髓的抽吸，人类MSCS一般从髂前上棘吸取，也可从胫骨、股骨、胸骨、腰椎等骨中获取，大动物MSCS的获取部位与人类相同，兔需抽取中段胫骨或股骨的骨髓。
间充质干细胞(MSCs)的分离方法研究
间充质干细胞（MSCs）的分离方法研究摘要：间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSCs)是一种来源于中胚层的成体干细胞, 具有多向分化能力，如具有向骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱、血管内皮细胞及神经星形胶质细胞分化的潜能。
并且MSC体外较易分离培养、扩增，细胞免疫原性低，易于转染并能长期表达外源基因等特点，故已成为组织工程、基因治疗和再生医学中的研究热点。
目前，对MSCs 的分离、纯化、培养还没有统一的方法。
MSCs的分离技术和方法主要有4种：贴壁法、流式细胞仪分离法、密度梯度离心法和免疫磁珠法。
本研究对传统的分离方法进行一些改进，联合利用密度梯度离心法和差异贴壁法，旨在体外分离培养血管MSCs ，并将其经定向分化诱导为成骨细胞、脂肪细胞和血管内皮细胞，并与骨髓MSC定向分化为血管内皮细胞进行比较，以观察血管来源MSC在血管内皮细胞分化及血管损伤修复中的优势，为临床血管病变性疾病的干细胞治疗提供更为合适的细胞来源。
关键词：间充质干细胞（MSCs），组织工程，流式细胞仪，差速贴壁培养法，定向分化，传代培养，CD13、CD29，多向分化1，资料与方法间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSCs)是一种来源于中胚层的成体干细胞, 具有多向分化能力，如具有向骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱、血管内皮细胞及神经星形胶质细胞分化的潜能。
MSC体外较易分离培养、扩增，细胞免疫原性低，易于转染并能长期表达外源基ha因等特点，故已成为组织工程、基因治疗和再生医学中的研究热点。
MSC存在于体内多种组织，人们已经从骨、脂肪、脐血及脐带等多种组织中成功分离培养出间充质干细胞，但血管组织中MSC的分离培养及功能研究未见报道。
骨髓是MSC分离培养的主要组织来源，但由于 MSCs还可以存在于人类、鸟类、啮齿类等生物的脂肪、血管等多种组织中，具有高度增殖、自我更新及组织再生和修复功能。
在体外成功分离培养血管MSC，并得到大量纯化的MSCs 是研究其分化机制、基因调控、以及在临床血管损伤修复应用等方面的前提。
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间充质干细胞（MSCs）的分离方法研究
发表时间：2016-11-29T12:22:49.340Z 来源：《医师在线》2016年10月第19期作者：唐立敏
[导读] 间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSCs)是一种来源于中胚层的成体干细胞, 具有多向分化能力。
江苏省泰州市人民医院检验科江苏泰州 225300
摘要：间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSCs)是一种来源于中胚层的成体干细胞, 具有多向分化能力，如具有向骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱、血管内皮细胞及神经星形胶质细胞分化的潜能。
并且MSC体外较易分离培养、扩增，细胞免疫原性低，易于转染并能长期表达外源基因等特点，故已成为组织工程、基因治疗和再生医学中的研究热点。
目前，对MSCs 的分离、纯化、培养还没有统一的方法。
MSCs的分离技术和方法主要有4种：贴壁法、流式细胞仪分离法、密度梯度离心法和免疫磁珠法。
本研究对传统的分离方法进行一些改进，联合利用密度梯度离心法和差异贴壁法，旨在体外分离培养血管MSCs ，并将其经定向分化诱导为成骨细胞、脂肪细胞和血管内皮细胞，并与骨髓MSC定向分化为血管内皮细胞进行比较，以观察血管来源MSC在血管内皮细胞分化及血管损伤修复中的优势，为临床血管病变性疾病的干细胞治疗提供更为合适的细胞来源。
关键词：间充质干细胞（MSCs），组织工程，流式细胞仪，差速贴壁培养法，定向分化，传代培养，CD13、CD29，多向分化1，资料与方法
间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSCs)是一种来源于中胚层的成体干细胞, 具有多向分化能力，如具有向骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱、血管内皮细胞及神经星形胶质细胞分化的潜能。
MSC体外较易分离培养、扩增，细胞免疫原性低，易于转染并能长期表达外源基ha因等特点，故已成为组织工程、基因治疗和再生医学中的研究热点。
MSC存在于体内多种组织，人们已经从骨、脂肪、脐血及脐带等多种组织中成功分离培养出间充质干细胞，但血管组织中MSC的分离培养及功能研究未见报道。
骨髓是MSC分离培养的主要组织来源，但由于 MSCs还可以存在于人类、鸟类、啮齿类等生物的脂肪、血管等多种组织中，具有高度增殖、自我更新及组织再生和修复功能。
在体外成功分离培养血管MSC，并得到大量纯化的MSCs 是研究其分化机制、基因调控、以及在临床血管损伤修复应用等方面的前提。
目前，对MSCs 的分离、纯化、培养还没有统一的方法。
MSCs的分离技术和方法主要有4种：贴壁法、流式细胞仪分离法、密度梯度离心法和免疫磁珠法。
应用流式细胞仪分离法或免疫磁珠法，虽可以得到纯度较高的细胞，但分离过程对细胞的活性影响较大，甚至导致细胞完全失去活性。
使用percol1 分离液梯度离心的方法，能有效地将红细胞、白细胞和间充质干细胞分离开来，同时操作简便，快速，对细胞的活性影响较小，但要是所得血管中细胞的量不多，分离得到的单个核细胞数量较少, 接种至培养瓶内细胞密度偏小，不利于细胞的生长。
本实验采用差速贴壁培养法及利用密度梯度离心联合分离培养大鼠血管间质干细胞, 通过观察MSCs 在体外分离、培养、扩增的过程,最后通过流式细胞仪进行间质干细胞的鉴定, 为下一步实验应用提供依据，也进一步增加了间质干细胞的来源。
目前认为，间充质干细胞的分离与培养必须在形态学上和功能学上均满足要求。
获得优良的种子细胞对于构建良好的组织工程人工组织具有非常重要的意义。
本研究对传统的分离方法进行一些改进，联合利用密度梯度离心法和差异贴壁法，使所获细胞纯度更高，在体外多次传代能保持良好的增殖和分化能力，生物学活性优良。
流式细胞仪检测均一表达CD13 、CD29 、CD44等。
其次，种子细胞的分化能力对组织工程构建人工组织的效果亦具有决定性的意义。
本研究旨在体外分离培养血管MSCs ，并将其经定向分化诱导为成骨细胞、脂肪细胞和血管内皮细胞，并与骨髓MSC定向分化为血管内皮细胞进行比较，以观察血管来源MSC在血管内皮细胞分化及血管损伤修复中的优势，为临床血管病变性疾病的干细胞治疗提供更为合适的细胞来源。
2，实验过程及结果
2.1 MSCs 的取材及原代培养：
取生后5～6 周的雄性健康大鼠, 颈部脱臼处死, 用75% 酒精浸泡1 min,分离出血管, 在装有PBS 液的培养皿内将血管清洗干净, 进行组织破坏后获得培养液的液体移入10 mL 的离心管中, 反复吹打后离心500 r /min, 5 min。
弃上清, 加入10% FBS 的L-DMEM培养液吹打混匀,离心800 r /min, 5 min。
弃上清, 再加入培养液重悬细胞, 调整细胞密度为5×105 个/mL 接种于25 cm2 培养瓶中, 置于37℃, 5% CO2, 95%饱和湿度培养箱中培养。
接种24 h 后全量换液, 去掉悬浮的细胞及其碎片和杂质, 以后隔天换液一次。
每天在倒置相差显微镜下观察、记录。
2.2 MSCs 的传代培养：
待原代细胞生长接近铺满瓶底约80%时, 去除培养液, PBS缓冲液轻洗3 次,加入0.25%胰蛋白酶以及0.02% EDTA, 37℃条件下消化3 min, 倒置相差显微镜下观察, 当细胞回缩、变圆、间隙增大时, 立即加入含10%FBS 的培养液终止消化。
用吸管轻轻吹打培养瓶底壁，制作单细胞悬液, 离心1 000 r /min, 5 min。
弃上清, 加入培养液, 按1∶2 比例接种到新的培养瓶, 置于37℃, 5%CO2, 95%饱和湿度培养箱中继续培养, 进行传代培养。
每2～3 d 换液1 次, 直至贴壁细胞成片, 接近铺满瓶底约80%时, 重复以上操作, 再次传代。
2.3 培养结果
培养24 h, 细胞已开始贴壁, 胞体呈圆形或多边形。
培养3 d, 贴壁细胞胞体明显增大并开始分裂增殖, 此时细胞形态渐变为梭形或纺锤形, 呈成纤维细胞样生长, 形成大小不一的集落。
通过更换培养液, 不贴壁的造血细胞等被去除; 残存的内皮细胞也应无法生长而死亡或者用
流式细胞仪进行二者的分离。
贴壁的MSCs 逐渐呈脊梁状、鱼群状、漩涡状、网状或辐射状排列, 细胞分裂增殖十分明显, 胞浆丰富, 核大,呈椭圆形(左图) 。
在9～10 d 左右, 培养的细胞长满培养瓶底的80%～90%并融合。
传代培养的MSCs 在形态学上更加趋于一致, 为排列更加有序的成纤维细胞样细胞, 生长旺盛,胞核明显。
培养6d 左右即可长满培养瓶底。
2.4.MSCs的鉴定
细胞传至第4代后,用消化液消化细胞, PBS洗涤2次(1 000 r /min) ,流式细胞术检测CD13、CD29的表达情况。
经流式细胞仪检测,MSCs 均一地表达CD13 、CD29 , CD44等; 而CD34 、CD45 和HLA-DR 阴性，经成骨细胞及成脂肪细胞定向分化鉴定其多向分化潜能。
2.5 实验流程如下图：
2.6 实验结果
本实验成功建立血管MSCs 的体外培养分离方法，获得血管MSC并对其进行表面标志及多向分化潜能鉴定，将为临床血管性疾病的损伤修复提供新的干细胞来源，开展人体自身的血管间充质干细胞的临床应用奠定实验基础。
参考文献：
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