兔骨髓间充质干细胞的分离

兔骨髓间充质干细胞的分离、体外培养、鉴定和体外标记

ｆＮａｃａｇＵｎｖｒｉ，ｎｈｎ３０６ＤｅａｔｎｆＰｔｏｈｓｏｏｙｉａｆｉｅｓｉｏｎｈｎｉｅｓｙＮａｅａｇ３００；ｌａｔｐｒｍｅｔｏａｈｐｙｉｌｇ，ＭｅｉａｏｌｇｆＮａｃａｇｄｃｌＣｌｅｏｎｈｎｅ
Ｕｎｖｒｉ；ｒｎｔｕｅｔｅＦｒｔｆｌｔｄＨｏｐｔｌｆＮａｃａｇＵｎｖｒｉ）ｉｅｔＢｕｎＩｓｔｔ，ｈｉｉｉｅｓｉｎｈｎｉｅｓｔｓｙｉｓＡｆａａｏｙ【ｓｒｃ】ＯｂｅｔｅＴｘｌｒｔｏｆｉｌｔｎｕｆａｉｎａｄｃｌｒｆｂｎｌｏｄｒｅｓｎｈｍａｔｍＡｂｔａｔｊｃｉ：ｏｅｐｏｅａｍｅｈｄｏｏａｉ，ｐｒｃｔｎｕｔｅｏｏｅｍａＴｗ— ｅｖｄｍｅｅｃｙｌｓｅｖｓｏｉｉｏｕｉ
ＭＣ表面抗原进行鉴定，明所培养的细胞为ＭＳｓ采用５溴脱氧尿嘧啶核苷ｆ一ｒｍ一一ｅｘｕｉｎ，ｒＵ体外标Ｓｓ证Ｃ。一５Ｂｏｏ２ｄｏｙｒｉｅＢｄ）ｄ记兔ＭＣ，测其标记阳性率。果：骨髓培养法培养的原代ＭＳｓＳ８检结全Ｃ接种４天后可以被观察到，形态均匀成梭形，长生
增殖迅速，合ＭＳｓ长的特性，～Ｃ融合接近８％，符Ｃ生７８ｄＭＳｓ０传代培养生长良好。Ｃ生长曲线呈Ｓ型，ＭＳｓ由生长曲线分析可知，Ｃ在培养第４８ｄ为高速生长期，Ｃ在第３５代生长最为旺盛。流式细胞术鉴定，Ｄ４一、Ｄ５一、ＭＳｓ～ＭＳｓ～经Ｃ３（）Ｃ４（）Ｃ４（）Ｃ０（）证明所培养的细胞为较纯的ＭＳｓＢｄＤ４＋、Ｄ１５＋，Ｃ。ｒＵ体外标记兔ＭＳｓ阳性率达到８％～０结论：用本Ｃ的５９％。应

兔骨髓间充质干细胞的分离培养及成骨诱导

ＴｕｏＺｈｅｎ．ｈｅ ’
１ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ，ＳｅｃｏｎｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＬａｎｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００３０，Ｇａｎｓｕ
关键词：
庾佳佳 ★ ，男，１９８５年生，
山西省新绛县人，汉族，兰州大学在读硕士，主要从事骨组织工程研究
干细胞；骨髓干细胞；骨髓间充质干细胞；密度梯度离心法；分离培养：成骨诱导；骨组织工程；兔；国家自然科学基金；干细胞图片文章
中国组织工程研究
第，７眷第６期
２０１３— ０２—０５出版
ＷＷＷ．ＣＲＴＥＲ．ｏｒｇ
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｉｓｓｕｅＥｎｇｉｎｅｅｎｎｇＲｅｓｅａｒｃｈＦｅｂｒｕａｒｙ５，２０１３Ｖｏ１．１７，Ｎｏ．６
兔骨髓间充质干细胞的分离培养及成骨诱导冰 ★
庾佳佳 ’ ，汪新柱，赵琳’ ，孙瑞’ ，闰雪萍。，张苍宇’ ，任广铁’ ，拓振合 ’
２甘肃省中医院放射科，甘肃省兰州市
１兰州大学第二医院骨科，甘肃省兰州市７３００３０７３００５０３兰州大学口腔医学院，甘肃省兰州市７３００００
．
养。

兔骨髓间充质干细胞的分离、体外培养、成骨诱导与鉴定

（广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科，广西南宁５３００２１）
摘要：目的建立一种兔骨髓间充质干细（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌ１．ＭＳＣ）体外分离培养、扩增及鉴定的方法。方法采用全骨髓贴壁培养法分离
原代和传代培养的ｒＢＭＳＣｓ具有活跃的增殖能力，成骨成脂诱导后，碱性磷酸酶染色、茜素红染色、ｖｏｎＫｏｓｓａ法染色、Ｉ型胶原免疫细胞化学
检测和油红。染色均呈阳性。成骨诱导电镜检测呈阳性。结论全骨髓贴壁培养法操作相对简单，可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞，
ＭｅｔｈｏｄｓＢＭＳＣｓｆｒｏｍｒａｂｂｉｔｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄ，ｃｕｌｔｕｒｅｄａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙｔｈｅｗｈｏｌｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗａｄｈｅｒｅｎｃｅｍｅｔｈｏｄ，ＴｈｅｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｕｎｄｅｒＰｈｓｅａ — ｃｏｎｔｒａｓｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅａｎｄｔｈｅｇｒｏｗｔｈｃｕｖｅｒｏｆｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｗａｓｄｒａｗｎａｃｃｏｒｄｉｎｇｌｙ．ＢＭＳＣｓｗｅｒｅｉｎｄｕｃｅｄｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｉｎｔｏｏｓｔｅｏｂｌｓｔａｓａｎｄａｄｉｐｏｃｙｔｅｓａｎｄｄｅｔｅｃｔｅｄＡｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔｓｅａａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅｐｏｉｎｔｓ．ＲｅｓｕｌｔｓＢＭＳＣｓｆｒｏｍｒａｂｂｉｔｓｗｅｒｅｓｐｉｎｄｌｅｃｅｌｌ — ｂａｓｅｄ，ｓｈｏｗｉｎｇｒａｄｉａｌｃｏｌ Байду номын сангаас ｎｙａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ．Ｔｈｅｒｏｇｔｈｗｃｕｒｖｅｗｅｒｅｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ￣；ｉｔｈｔｈｅｒｏｇｗｔｈｃｈａｒａｃｔｅｉｓｒｔｉｃｓａｎｄｇｏｏｄａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｎｏｒｍａｌｃｅｌｌｓ．Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇｉｎｄｕｃｔｉｏｎ，ｏｉｌｒｅｄＯ

兔骨髓间充质干细胞的体外培养及相关检测的实验研究

中医正骨２１０１年１第２１月３卷第１１期
・
（８３３・总０）・
基础研究・
兔骨髓间充质干细胞的体外培养及相关检测的实验研究
王萧枫童培建金红婷吴银生，，，
（．１浙江省温州市中西医结合医院，浙江温州３５０；．１２００２浙江中医药大学，浙江杭州３０５）１３０
ＷｎｈｕＣｔ，ｅｚｏ２００Ｚｅａｇ，ｈｎｅｚｏｉＷｎｈｕ３５０，ｈｆｎＣｉｙｉａ
ＡＳＲＴＯｂｅｔｅＴｘｌｒｔｐｒａｈｓｔｉｌｔ，ｕｕｅａｄｉｅｔｙｔｅｂｎａｏｓｎｈｍｌｔｍｃｌ（Ｃ）０ＢＴＡＣｊｃｉ：ｏｅｐｏｅｈａｐｏｃｅｏａｃｌｒｎｎｉｈｏｅｍ￣ｗｍｅｅｃｙａｓｅｌＭＳｓｆｖｅｏｓｅｔｄｆｅｓ
ｒｂｉｎｖｔｏＭｅｈｄ：ａｂｔＭＳｅｅｅｔｃｅｈｏｇｈｅｓｔｒｄｅｔｅｔｆｇｔｎａｄｓｐｒｔｎｏｅｃｍｂｎｔｎａｈｒａｂｔｉｉ．ｓｒｔｏｓＲｂｉＣｓｗｒｘｒｔｄｔｒｕｈｔｅｄｎｉｇａｉｎｎｒｕａｉｎｅａａｉｆｔｏｉａｉｄｅ－ａｙｃｉｏｏｈｏ
ｅｔｃｌｇｏｔａｅａｄｍｏｐｏｏｉａｈｎｅｓｏｓｒｅｓｎｅｉｖｒｄｍｉｒｓｏｅｓｌｃｈ３ｃｌｎｕｅｓｎｐｃａｄａｎ，ｅｌｒｗｈｒｔｎｒｈｌｇｃｌａｇｓｗａｂｅｖｄｕｉｇｔｎｅｅｃｏｃｐ，ｅｅｔｅＰｅｌｉｄｃｄｕｉｇｓｅｉｍｅｉｃｈｔｔｓｌｓｐｌｍｅｔｄ，ｂｅｖｈｅｓｂｌｙｏｉｅｅｔａｉｎｉｔｏｅｃｌ，ａｅｌ，ａｔｌｇｅｌ．ｘｒｓｉｎｏ２Ｃ４Ｃ４，Ｄ５ｗｓｕｐｅｎｅｏｓｒｅｔｅｆａｉｉｔｆｄｆｒｎｉｔｎｏｂｎｅｌｆｔｃｌｃｒａｅｃｌＥｐｅｓｏｆｉｆｏｓｓｉｓＣＤ９，Ｄ４，Ｄ３Ｃ４ａｄｔｃｅｓｎｏｙｏｔ．ｓｌ：ｈｕｕｅｅｌｈｗｉｇｌｎｕｉｒａｄｆｒｂａｔｉｅｇｏｔｐａｔｔｃｍｅｔａｄｒｐｄｅｅｔｄｕｉｇｆｗｃｔｍｅｒＲｅｕｔＴｅｃｈｒｄｃｌｓｏｎｏｇｆｓｆｍｎｂｏｌｓ－ｌｒｗｈ，ｌｓｉａｔｈｎｎａｉｌｙｓｓｏｉｋｃａ

兔DCM造模及骨髓间充质干细胞培养方法学的研究

ｗｅｒｅｋ，ｎｅｏｅｊｔｇａｒｍｃｍ／ｇｂｄｔｗｃｅｋｆｅｋ．ｏｐｒｔｆｃｎｙｏｔｏｅｋｆｗｅｓａｄｔｔｒｓｎｅｉｄｉｙｉ１ｇｋｏｙｗｉａｅｒｗｅｓＷｅｃｍａｅｅｉｃｆｗｏ８ｈｈｉｉｃｎａｎｔｅｗｏ８ｅｈｉｅ
在为研究ＤＭ治疗方法的选择以及临床疗效的观察奠定基础，细胞移植的准备提供方法学依据。方法Ｃ为
１每次２ｍ／ｇ及每周２次每次１ｇｋ，连续８的给药方式进行兔ＤＭ模型的制备，药结束后３周处死动次ｇｋ，／ｇ均ｍ周Ｃ给
亡率和体重减轻率无统计学差异。应用密度梯度离心法和全骨髓培养法均可获得ＭＣ，Ｓｓ但所获细胞纯度及其生物学特性略有差异。结论
的选有效，两种给药方式模型制备效果一致，推荐使用１１的周次
给药方式；种培养方法均可获得ＭＣ细胞，根据不同实验中具体需要的细胞数量和细胞纯度进行不同培养方法两Ｓｓ可关键词：张型心肌病；物模型；髓问充质干细胞；外培养；扩动骨体兔
ｆｏｂｎｒｏｆａｂｔＳＮｎＪＮｈａｇｑａ，ＩＮＪ－ｅ，ｔ１（ｅａｔｅｔｆＵｔｓｕｄＴｅｏｄｆｌｒｍｏｅｍａｒｗｏｂｉＵＭｉ，ＩＧＳｕｎ－ｕｎＴｉｗｉｅａ．Ｄｐｒｎｏｌｏｎ，ｈ＆ｃｎ：ｉｒＡＡａｍｒｏＡｆ — ｉ

兔骨髓间充质干细胞的分离、扩增及诱导分化

胞诱导，４ｄ成骨细胞诱导组检测碱性磷酸酶，脂肪细胞诱导组进行油红０染色。结果全骨髓贴壁培养１后成
法可获得ＢＭＳｓ原代和传代培养的ＢＭＳｓＭ．Ｃ，Ｍ．Ｃ具有活跃的增殖能力。成骨细胞诱导组碱性磷酸酶检测表
【摘要】目的探讨兔骨髓间充质干细胞（ｏｅｍａｒｗｍｅｅｃｙｌｔｍｅｌ，Ｍ— Ｃｓ体外培养、向ｂｎｒｏｓｎｈｍａｓｃｌＢＭＳ）ｅｓ定诱导分化为成骨细胞和成脂肪细胞的途径，为进一步的实验研究打下基础。方法抽取兔股骨骨髓，以全骨髓贴壁培养法进行体外培养，贴壁细胞传代，倒置显微镜下观察细胞形态。取第３代细胞向成骨细胞和成脂肪细
Ｃｈｎｓｅｉａｎｖｒｉ，ｎｉｇｉｅｅＭｄｕｎｘ３０１ｙａｇｉ５０１，Ｃｈｎｉａ
［ｂｔａｔＯｂｅｔｅＴｎｅｔａｈｕｔａｉｎｉｉｏｏａｂｔｂｎｒｗｓｎｈｍａｓｍｅｌＡｓｃ］ｒｊｃｖｏｉｖｓｇｔｔｅｃｌｖｔｎｖｔｆｒｂｉｏｅｍａｒｍｅｅｃｙｌｔｃｌｉｉｅｉｏｒｏｅｓ（Ｍ．Ｓ）ｔｅｎｕｔｎｎｄｆｒｎｉｔｎｆＭ．ＳｓｎｏｔｏｌｔｎｄｉｏｌｓｆｒｕｔｅＢＭＣｓｈｉｄｃｉａｄｉｅｅｔｉｏＢＭＣｉｔｓｂａｓｏｆａｏｏｅｓａｌｂａｔｏｆｒｒｐｓｈ
【关键词】骨髓问充质干细胞；细胞，培养的；因扩增；基细胞分化；兔中图分类号：１２．４文献标识码：文章编号：６４６６２１）１０４．３１９２３Ａ１７－６Ｘ（０００－０９０

幼兔髂骨穿刺抽取骨髓间充质干细胞分离培养鉴定：注意的细节与技术

幼兔髂骨穿刺抽取骨髓间充质干细胞分离培养鉴定：注意的细节与技术张聪;刘洪美;李庆伟;陈国武;梁啸;孟纯阳【摘要】背景：骨髓间充质干细胞被认为是构建组织工程骨修复骨与软骨缺损中较为常用的种子细胞，在其基本操作过程中注意常见问题并及时避免，对后期细胞学及组织工程学实验很有意义。

目的：通过作者实验操作过程中所遇问题的总结和分析，为初学者和科研人员提供可靠的骨髓间充质干细胞分离培养鉴定方法，减少操作过程中的人为失误和易犯问题。

方法：取16只幼年新西兰大白兔作为实验对象，进行髂骨穿刺抽取骨髓液。

采用密度梯度离心法联合贴壁培养法体外筛选纯化细胞，并且通过倒置相差显微镜观察其形态学特点、生长曲线和流式细胞术鉴定骨髓间充质干细胞表型。

结果与结论：实验过程中前5只兔骨髓抽吸、骨髓间充质干细胞分离过程中遇到不同的问题和困难，经认真总结和分析，后11只兔骨髓抽吸、骨髓间充质干细胞分离均获成功，在细胞培养过程中未发现细菌污染和细胞老化，第3代骨髓间充质干细胞高表达CD29、CD44抗原，而CD14、CD34抗原低表达，MTT测细胞生长曲线显示P3和P5增殖活性较高。

尽管骨髓间充质干细胞分离培养鉴定技术已较为成熟，但是如果操作过程中不注意细节问题，也将会导致实验困难重重或失败。

严格执行常规操作步骤可以得到纯度较高的骨髓间充质干细胞，提高成功率，为后续相关细胞实验和动物实验做好准备。

%BACKGROUND:Bone marrow mesenchymal stem cells are considered as commonly used seed cells to construct tissue-engineered for repair of bone and cartilage defects. It is of great significance for cytology and tissue engineering experiments to study the common problems existing in the basic operation and how to avoid these problems in a timely manner.OBJECTIVE:To summarize the common problems existing in the process of operation in order to provide reliable methods about separation, culture and identification of bone marrow mesenchymal stem cells for beginners and researchers. These can reduce or avoid some errors and problems during operation. METHODS:Sixteen New Zealand white rabbits were selected as experiment objects, and bone marrow mesenchymal stem cells were separated from rabbits by iliac puncture, purified and augmented by using density gradient centrifugation combined with adherent culture method. Then cellmorphology was observed by inverted phase contrast microscope, growth curve detected by MTT method and cellphenotype identified by flow cytometry. RESULTS AND CONCLUSION:We encountered some problems in the process of separation and culture, when we operated the first five rabbits. After careful y summarizing and analysis of the reasons, the operation was successful y completed on the rest 11 rabbits. Bacteria pol ution and cellaging were not found in the process of cellculture. What is more, the cells at passage 3 appeared with high-expression of CD29, and CD44, but low expression of CD14 and CD34. The cellgrowth curve showed that the proliferation activity of cells at passages 3 and 5 was higher than that at passage 10. Although the technology of separation, culture and identification of bone marrow mesenchymal stem cells is mature, the failure wil be happen if we do not pay attention to the details of operation. By strictly carrying out normal operations, we can get high purity of bone marrow mesenchymal stemcells, which lays a good foundation for celland animal experiments in the future.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2014(000)023【总页数】6页(P3639-3644)【关键词】干细胞;骨髓干细胞;骨髓间充质干细胞;种子细胞;细胞培养;表型鉴定;兔;山东省自然科学基金【作者】张聪;刘洪美;李庆伟;陈国武;梁啸;孟纯阳【作者单位】济宁医学院附属医院脊柱外科，山东省济宁市 272000;济宁医学院病理教研室，山东省济宁市 272000;济宁医学院附属医院脊柱外科，山东省济宁市 272000;济宁医学院附属医院脊柱外科，山东省济宁市 272000;济宁医学院附属医院脊柱外科，山东省济宁市 272000;济宁医学院附属医院脊柱外科，山东省济宁市 272000【正文语种】中文【中图分类】R394.20 引言 Introduction骨髓组织中除含有造血干细胞外，还含有少量的骨髓间充质干细胞[1]。

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定及DiI荧光标记

ｏＤ２ｎｆＣ９ａｄＣＤ１６ｏｅｌｗｅｅａａｙｅｙｕｉｇｉ０ｆｉｒｎｌｚｄｂｓｎｍｍｕｏｙｏｈｍｉｔ．ｈｈｒｅｅａｉｎｏＣｓｌｂｌｄｂｉ．ｃｓｎｅｔｃｅｓｙＴｅｔｉｇｎｒｔｆｒｄｏＭＳｓｗａａｅｅｙＤＩＴｅｌｂｌｇｅｆｉｎｙｗｓｄｔｃｅ．ｅｕｔ：ｈｒｒｕｔｒｄＭＳｓａｈｒｄｔｌｓｉｕｆｃｔｉ８ｈａｄｒａｈｄｈａｅｉｆｃｅｃａｅｅｔｄＲｓｌＴｅｐｉｙｃｌｅＣｄｅｅｏｐａｔｓｒｅｗｉｎ４ｎｅｃｅｎｉｓｍａｕｃａｈ９％ｃｎｕｎｅｗｉｉ — ．Ｃｘｒｓｅ０ｏｆｅｃｔｎ７８ｄＭＳｓｅｐｅｓｄＣＤ２ｎＤ１６Ａ１ｏｅＭＳｓｓｏｅｄｆｏｅｃｎｅｂｍｍｕｏｕｒ — ｌｈ９ａｄＣ０．１ｆｈＣｈｗｄｒｕｒｓｅｃｙｉｔｅｌｎｆｏｏｌ
ｃｉ（Ｓｓｉｖｒ．Ｍｅｈｄ：ＳｓｅｅｓｌｅｎｕｔａｄｙｅｓｙｒｄｅｔｎｄｅｅｔｅｏｓＴｅｘｒｓｉｓｅｌＭＣ）ｎｉｏｓｔｔｏｓＭＣｒｉａｄａｄｃｌｖｔｎｉａｉｄａｈｒｎｔｄ．ｈｐｅｓｎｗｏｔｉｅｂｄｔｇｎａｍｈｅｏ
汇合；免疫细胞化学方法检测细胞表面标志抗原Ｃ２，Ｄ０Ｄ９Ｃ１６为阳性；ｉ进行细胞标记后，荧光显微镜下见所有ＤＩＭＣ均被标记为红色荧光，Ｓｓ敏感性好，标记效率高。结论：此培养方法可以作为培养兔ＭＳｓＣ的常规方法，为构建组织工程尿道提供充足的种子细胞。关键词骨髓细胞间质干细胞细胞，培养的细胞分离免疫组织化学荧光抗体技术流式细胞术兔

不同年龄兔骨髓间充质干细胞的体外生长特性分析

【摘
要】目的观察不同年龄兔骨髓间充质干细胞（ＭＣ在体外分离、、ＢＳ）培养扩增的过程，并对其生长
特性进行初步比较分析。ＢＣ的临床应用提供技术方法和依据。方法选取出生１、８月、６月的健康中为ＭＳ月１３国白兔。成新生、分成年、年３组，用密度梯度离心技术及贴壁筛选法相结合，老采分离培养ＢＣ，ＭＳ用噻唑蓝（ｒ法观察其增殖及生长特征，ＭＹ）用流式细胞仪检测细胞表面标志。结果各组ＢＣ均贴壁生长，ＭＳ呈成纤维细胞样ＢＣ典型形态，ＭＳ贴壁率的观察和生长曲线显示，在相同的培养条件下，新生兔细胞增殖最快，细胞可扩增能力最强，而老年兔细胞增殖最慢，细胞可扩增能力最弱，成年兔细胞介于两者之间。结论利用密度梯度离心法结
ｓｐｒｔｄａｄｐｒｆｄｗｔｅｓｙｇａｉｎｅｔｆｇｔｎｃｍｂｎｄｗｉｄｅｅｃｔｏｎｖｔ．ＴｅｐｏｉｒｔｎｅａａｅｎｕｉｉｄｎｉｒｄｅｔｎｒｕａｉｏｉｅｔａｈｒｎｅｍｅｈｄｉｉｏｉｅｈｔｃｉｏｈｒｈｒｌｅａｉｆｏａｄｐｔｒｆｇｏｈｗｒｔｄｅｙＭＴｒｅｓｙｉｒｒｎａｓｇｕｔｒ．Ｔｅｓｒｃｌｃｌｘｒｓｉｎｆｎａｔｎｏｒｗｔｅｅｓｕｉｄｂｅｓａｎｐｍａｙａｄｐｓａｅｃｌｅｉｕｈｕｆｅｍｏｅｕｅｅｐｅｓｏｓｏａｃｌｅｅｅａｎｄｂｏｙｏｔ．ＲｅｕｔＢＣｓｗｒｏｎｏａｈｒｎｏｗａｌｎｒｓｎｉｙｉａｅｌｗｒｘｍｉｅｙｆｗｃｔｍｅｒｓｌｙｓｌｓＭＳｅｅｆｕｄｔｄｅｅｔｌａｄｐｅｅｔｗｔａｔｐｃｌｔｓｈ

兔骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定

・椎间盘退行性变的生物治疗研究专题・
兔骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定
刘康，白亦光，陈竹，韩小伟，杨泽龙，赵
教研室，四川Ｉ南充６３７００７）
明。，宋桂芹，冯刚
（１．ＴｉｓｓｕｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄＳｔｅｒｎＣｅｌｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＮｏｒｔｈＳｉｃｈｕａｎＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，ＮａｎｃｈｏｎｇＣｅｎｔｒａｌＨｏ￣ｉｔａｌ；２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｉｏｌｏｇｙ，
６３７０００；２．川北医学院医学生物学
（１．川Ｉ北医学院第二临床医学院・南充市中心医院组织工程与干细胞研究所，四川南充
【摘
要】目的：探讨一种简便可行的兔骨髓间充质干细胞（ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｄｅｒｉｖｅｄｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＢＭＳＣｓ）体外分离培
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ｆｏｒｄｒａｗｉｎｇｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅｓ．Ｉｎｖｅｒｔｅｄｐｈａｓｅｃｏｎｔｒａｓｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｗａｓｕｓｅｄｔｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｃｅｌｌｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ．ＢＭＳＣｓｗｅｒｅｉｎ－ｄｕｃｅｄｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｉｎｔｏｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ，ｗｈｉｃｈｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙＳａｆｒａｎｉｎ一０ａｎｄｆａｓｔｇｒｅｅｎｓｔａｉｎｉｎｇａｎｄｔｏｌｕｉｄｉｎｅｂｌｕｅｓｔａｉｎｉｎｇｒｅｓｐｅｃ —

兔骨髓间充质干细胞体外BrdU标记的实验研究

３％戊巴比妥钠按１
ｍ／ｇ经耳缘静脉行全身麻醉，Ｌｋ于双侧胫骨上端内侧
部及双侧髂后上嵴取骨髓血约４ｍ。立即用等量的Ｌ
ＰＳ洗涤后离心，Ｂ弃去上清液，重复２次后即可采用全
ＭＳｓＣ的体外标记，旨在探讨其标记方法，索其标记探
嘧啶核苷（５一ｂｏｏｒ一２一ｄｏｙｒｉｅＢｄ因无放ｍｅｘｕｄ，ｒＵ）ｉｎ
司，北京）鼠抗兔Ｂｄ，ｒＵ单克隆抗体（北京中杉金桥公
司）过氧化物酶标记的链酶卵自素染色试剂盒（，北京中杉金桥公司）浓缩型ＤＢ试剂盒（，Ａ北京中杉金桥公司）等。
【关键词】骨髓间充质干细胞；５一溴脱氧尿嘧啶核苷；兔；全骨髓培养法
骨髓间充质干细胞（ａｒｍｒｗ—ｄｒｅｅｅｃｙａｏｅｖｄｍｓｎｈｍｌｉｓｒｃｌ，Ｓｓ在组织工程学中的应用首先遇到的ｔｎｅｓＭＣ）ｅｌ困难之一是如何标记待移植的ＭＳｓ进而跟踪其存Ｃ，活、归巢 ” 生长、化等一系列过程。５一溴脱氧尿 “ 、分
进行观察，发现贴壁细胞胞体回缩，细胞间隙增大或者少量贴壁细胞漂浮时，即加入等量含ＦＳ的培养基立Ｂ终止消化，并用无菌吸管轻柔吹打瓶壁细胞，促进细胞脱壁。多数细胞脱离瓶壁形成细胞悬液后，按照１２：重新接种至７Ｌ培养瓶中，５ｍ至第３代备用。
增高，０ＩｏＬ及７４ｍｌｘ／２ｈ标记阳性率达８％９％。结论５５

兔骨髓间充质干细胞体外分离培养研究近况

２ｏ。２４：１２０５１（）２ —２．
炎大鼠血清Ｉ－￣雕ＬＩ和［７方勇飞，１］王勇，周
志，ｏ５３（）７８１．２ｏ，０９：０ —７１
新，．等青藤碱对佐剂性关节炎大
［］６薛
鸾，胡惠平，胡建东，．气清络方对大鼠胶原性等益
维普资讯
２０年第１卷第３０７０期［］３张厚利，齐艳，杨
广西中医学院学报
・９・３
彤，．症停合剂对大鼠佐剂性等痹
诱导性关节炎大鼠滑膜细胞白介素．ｍＡ表达的影６ＲＮ
关节炎的防治作用及其机制研究［］中成药，０４２Ｊ．２０，６
（）３１８．５：８ —３４
［］春燕，９李梁清华，王安宁，．等痹肿消汤对胶原诱导性关节炎大鼠滑膜白细胞介素１ｍＮ０ＲＡ的影响［］实用预Ｊ．
防医学，ｏ６１（）１０ —１０．２ｏ，３５：１３１５［０何东仪，婷，伟，．１］姜冯等问荆合剂对 Ⅱ型胶原诱导
鼠滑膜细胞核因子出信号转导的影响及其机制［］Ｊ．中国临床康复，０５９７：４２５２ｏ，（）２ — ０．０［８郭１］垣，于孟学，姜玉娟，．等雷公藤单体Ｔ对Ｉ刺４Ｌ１
激引起的类风湿患者关节滑膜成纤维细胞增殖和产生
关节炎作用的拆方研究［］浙江中医杂志，０５４Ｊ．２０，０
维，张
磊，周艳丽，．等痹祺胶囊对类风湿关节炎

兔骨髓间充质干细胞的制备及诱导成骨的实验研究

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维普资讯
第１３卷４期
２００７年１２月
天津医科大学学报
ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＴＩＡＮＪＮＭＥＤＩＩＣＡＬＵＮＩＶＥＲＳＴＩＹ
Ｖｏ．１．１３Ｎｏ
Ｄｃ２０ｅ．０７
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兔骨髓间充质干细胞体外成内皮细胞能力的研究

兔骨髓间充质干细胞体外成内皮细胞能力的研究何朝荣;张群林;黄从新【期刊名称】《中华老年多器官疾病杂志》【年(卷),期】2003(2)4【摘要】目的探讨骨髓间充质干细胞体外扩增及其向内皮细胞定向分化能力.方法无菌条件下采集兔骨髓,肝素抗凝,经淋巴细胞分层液密度梯度离心分离骨髓单个核细胞,通过贴壁培养法获得MSC,然后在内皮细胞生长环境中进行诱导分化,最后对扩增的细胞特征进行鉴定,同时初步研究其体外成血管特性.结果 MSC每扩增一代,细胞数量增加5～8倍,7.65×103个原代MSCs体外扩增3代即获得1.26×108个细胞.在70%～80%融合时呈现"铺路石"样形态,细胞免疫组化证实扩增细胞表达CD31和yon Willebrand factor(vWF),具有吞噬ac-LDL的功能,且扩增细胞在体外参与网状血管样结构形成.结论 MSC扩增能力强,在体外能诱导其向内皮细胞方向分化.【总页数】5页(P287-291)【作者】何朝荣;张群林;黄从新【作者单位】442000,十堰市,郧阳医学院附属太和医院心血管内科;442000,十堰市,郧阳医学院附属太和医院心血管内科;武汉大学附属第一医院湖北省人民医院【正文语种】中文【中图分类】R3【相关文献】1.PPARγ基因干扰体外对兔骨髓间充质干细胞成脂基因的影响 [J], 白祥;禹宝庆;黄建明;许大峰2.兔骨髓间充质干细胞的分离、体外培养、鉴定及成脂诱导 [J], 戚宗泽;罗云飞;侯勇;郭永章;朱洪3.三种细胞因子体外联合诱导兔骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞的分化 [J], 陈毅;刘丹平4.兔骨髓间充质干细胞体外诱导血管内皮细胞 [J], 常青;程燕;高静媛;梁芳倩;于晓龙5.血管内皮细胞对骨髓间充质干细胞成骨能力影响的体外研究 [J], 曲哲;孙宏晨;郭英;张泽兵;杨儒壮;欧阳喈因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

BMSCs的分离培养、纯化与鉴定

BMSCs的分离培养、纯化与鉴定作者：马民吕志刚杜以宽张桂娟马义【摘要】目的建立一种持续、稳定的可多向分化的骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离培养体系。

方法运用密度梯度离心法从1月龄新西兰兔骨髓中分离培养BMSCs，利用相差显微镜观察其形态及生长情况，扫描电镜观察其细胞结构，运用流式细胞术分析分离细胞群所处细胞周期和细胞活力，用MTT比色法绘制细胞生长曲线，并用特定诱导液将分离的BMSCs向成骨细胞和成脂肪细胞定向诱导分化，利用ALP和油红O进行染色鉴定。

结果所分离的BMSCs细胞在形态学观察与生长动力学上均符合BMSCs特征，分离培养的BMSCs细胞在第3天进入对数生长期，第10天进入平台期；在成骨、成脂肪的诱导培养条件下，分别出现成骨、成脂肪表型特征，可进一步定向分化，结论所收获的细胞具有BMSCs的特异性。

【关键词】骨髓间充质干细胞；分离；成骨分化；成脂分化【Abstract】 Objective To establish a sustained and stable bone marrow derived mesenchymal stem cells (BMSCs) isolation and culture system which could be pluripotential in vitro. Methods BMSCs were isolated and cultured from the 1month old New Zealand white rabbits through density gradientcentrifugation. Growth and ultromicrostructure of the BMSCs were observed by light microscope and scan electron microscope. The cell activities and cell cycle were observed by flow cytometry. The grow curve of the BMSCs was described through MTT assay. BMSCs were induced and differentiate into osteoblasts and adipocytes by specific induction culture medium. Then the cells were stained with alkaline phosphatase (ALP) and Oil red O , and analyzed the result of all staining. Results The isolated BMSCs cells were in line with the characteristics of BMSCs in morphology and growth kinetics, and the isolated BMSCs cells would be into the logarithmic growth phase in the third day and into the platform phase in the tenth day. Conclusions In the osteogenic and adipogenic induced culture conditions, BMSCs have appeared the phenotypic characteristics of osteogenic and adipogenic respectively, and could be further directed differentiation. These indicated the harvested cells possessed BMSCs specificity.【Key words】 Bone marrow derived mesenchymal stem cells(BMSCs); Isolation; Osteogenic differentiation; Adipogenic differentiation软骨组织工程技术〔自体软骨细胞的移植、生长因子对软骨细胞的作用、骨髓间充质干细胞（又称骨髓基质干细胞，BMSCs）在软骨组织工程中的作用、转基因技术〕是当今的研究热点〔1，2〕。

兔骨髓间充质干细胞体外分离培养及生长特性的初步研究

ｅｉｅｅｅｃｙｌｓｅｃｌ（Ｓ．Ｍｅｈｄ：５ｏｅｍａｒｗｓｔｋｒｍｌｍｓｏｗｒｏｄｒｖｄｍｓｎｈｍａｔｍｅｌＭＣ）ｓｔｏｓｍｌｎｒｏｗａａｅｆｏｉｕｆＮｅｂｉ
ｓｃｅｓｕｌｎｖｔｏａｄｃｎｂｓｄｉｉｓｅｅｇｎｅｉｇｕｃｓｆｌｉｉｒｎａｅｕｅｎｔｕｎｉｅｒｎ．ｙｓ
ＫＥＹＯＲＤＳ＠ＢｎｒｏｄｒｖｄｍｅｅｃｙｌｔｍｅｌＣｅｌｕｔｒＲａｂｔＷｏｅｍａｒｗ— ｅｉｅｓｎｈｍａｅｃｌｓｓｌｃｌｕｅｂｉ
ｐｏｉｒｔｎｂｌｙｆＭＳｄｃｉｅｔｔｆｔｅｕｔｒ．Ｃｏｃｕｉｎ：ＭＳｃｎｅｕｔｖｔｄｒｌｅａｉａｉｔｏｆｏｉＣｅｌｄｗｉｎｈｉｍｅｏｈｃｌｕｅｎｌｓｏＣａｂｃｌｉａｅ
骨髓穿刺法抽取雄性新西兰白兔髂骨骨髓５，合应用密度梯度离心及贴壁培养法分离ｍｌ联
纯化ＭＳ并进行体外扩增，置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、Ｃ倒生长情况，数细计
胞数目，制细胞生长曲线。绘ＨＥ染色光镜观察细胞形态。结果：成功建立了兔ＭＳＣ体外分
Ｚｅａｗｈｉｅａｂｔ；ｔｅｎｆｅｔｅｅｎｉｙｒｄｉｎｔｅｒｆａｉｎ，ｍｏｎａｌｎｄｔｒｂｉｈａｔｒｈｄｓｔｇａｅｃｎｔｉｕｇｔｏｏｎｕｃｅｒｅｌｗｅｅｏｔｎｌａｃｌｓｒｇａｄ

两种不同方法分离兔骨髓间充质干细胞的生物学特性研究

ＬＰｎｃＬＷｅＸｉｏｈｎＤｅａｔｎｏＯｈｐｄｃ，ｈｅｏｅＨｏｐｔｌＳａｘｉｄｃｌｎｖｒｉ，ａｕｎ０００ｉｅｇｕｉａｃｕ．ｐｒｍｅｔｆｒｏａｉｓＴｅＳｃｎｔｓｉｈｎＭｅｉａＵｉｅｓｔＴｉａ３０１ａｙＹ
ｗｅｅｅａｄｇｏｓ，ｉｏｏｉａｌｎｌｃｒｎｍｉｒｓｏｌ．ｈｒｌｅａｉｎｏｔｅｃｌｓｘｍｉｅｙＨ — Ｒｉ— ｒｘｍｅｒｓｌｈｓｌｇｃｌａｄｅｅｔｃｏｃｐｙＴｅｐｏｉｒｔｆｈｅｌｗａａｎｄｂＴｄｙｔｙｏｆｏｓｅｎ
干细胞进行表型鉴定。结果
行伞骨髓培养法和梯度密度离心培养法分离骨髓问充质干细胞，用倒置显微镜、
今骨髓培养法的骨髓间充质干细胞，代培养周期为ｌ原４天，代及传代细胞一致原
透射电镜观察细胞生长状况，Ｈ标记的胸腺嘧啶脱氧核苷（ —ｄ掺入实验检测细胞的增殖情况，ＴＲ）Ｈ对骨髓间充质表达Ｃ４，胞 —ｄＤ４细ＨＴＲ掺入实验每分钟脉冲数为１２０ｐ梯度密度离心法的骨髓间充质干细胞，５５ｃｍ：原代培养周期为２８天，代及传代细胞表达Ｃ４，胞 —ｄ原Ｄ４绌ＨＴＲ掺入实验每分钟脉冲数为１５０ｐ结论用全骨髓培３７ｃｍ。
［ｓａＯＯｊｃｖｓＴｍａｅｒｌｅａｏｄｕｆｃｔｅｍｅｅｃｙｌｔｌｏｔｏｉＡｂ￣ｃｂｅｔｅｏｏｐｒｔｏｉｒｔｎｎｒｅｎｉｎｆｓｎｈｍａｓｍｃｌｉｌｅｂｔｆｉｃｅｈｐｆｉａｓａａｇｏｅｅｓｓａｄｙｗｄ－

兔骨髓间充质干细胞的分离培养及肝内示踪

学院动物伦理委员会的标志和规定，察１周后正观常的新西兰大白兔用于试验研究。
１２方法．
作用提供依据。但这些方法也存在一定的缺陷，如
Ｙ染色体只能应用于不同性别间细胞移植的探查，而绿色荧光蛋白（ｒｅｌｒｓｅｅｒｔｉ，ＧＦｇｅｎｆｅｃｎｅｐｏｅｎｕＰ）
养基，光共聚焦显微镜（ｅｓＳ５０ — 激Ｚｉ，ＬＭ１５ＭＥｓ
ＴＡ）下进行观察。
１２５兔急性／急性肝功能衰竭模型的建立及．．亚
ＭＳｓ的移植Ｃ
１２只新西兰成年大白兔（５只，雌雄
自体取材，体外扩增，具有良好的可塑性也不涉及伦理争议，组织工程和细胞治疗的理想种源细胞。是
ＭＳｓＣ在体外可分化为脂肪、骨、骨等中胚层的成软
踪其在肝损伤兔受体肝组织内的分布和整合，一进
７只）兔耳缘静脉注射Ｄ．基半乳糖２５ｍｍｏ／，氨．ｌｋ，造急性／ｇ建亚急性肝功能衰竭模型。２耳缘４ｈ后静脉内注射０１ｍＬＭＳＳ细胞液，度为１０／．Ｃ浓 ×１
ｍｉ￣５ｍｉ，ｎｎ待消化基本完全，轻轻利用移液管收集
生产，由中国科学院昆明动物研究所惠赠，病毒滴度
． ×ｌＵ／以不同ＭＯＩ（毒数／值病细胞Ａｌｒｈ公司）塑料培养瓶， — Ｍ＋１／为４８０ＴｍＬ）ｄｉｃ的ａＭＥ０ｍＬＬ数）添加到培养基中，ＭＳｓ培养８，新鲜培与Ｃ共ｈ换ＦＳＢ＋青链双抗（ｉｍａＡｌｒｈ公司）在３ ℃ 、Ｓｇ — ｄｉｃ，７体积分数为５Ｃ：培养箱（ｅｍｏＦｒＯＴｈｒｏｍａ公司）中培养。倒置显微镜（ｋｎＥＩＳＮｉｏＣＬＰＥ公司）每天下观察细胞生长情况并记录。１ｄ后半换液去除未贴壁细胞的同时并去除未贴壁细胞。待细胞汇合至

兔骨髓间充质干细胞的分离培养

Ｐｒｐｒｔｏｎｌｉａｉｎｏｂｉｎａｒｗ— ｅｉｅｅａａｉｎａｄＣｕｔｖｔｏｆＲａｂｔＢｏｅＭｒｏｄｒｖｄＭｅｅｈｍａｅＣｅｌｓｎｃｙｌＳｔｍｌｓ
ＹＡＮＹｉｇｙｎＺＡＮＧｉｇｆｎ，ａ — ＷＡＮＧｎｚｕｎｎ — ｉｇ ’ Ｈ，Ｊｎ —ａｇＨＥＸｉｏｅ，Ｘｉ—ｈａｇ＇
பைடு நூலகம்
摘要：为探讨体外分离及培养扩增兔骨髓间充质干细胞（Ｃ）ＭＳｓ的方法，菌采取兔股骨，无用含２ＦＳ的ＤＭＥ培养液冲骨髓腔，０ＢＭ采用全骨髓细胞贴壁培养法对ＭＳｓ行纯化扩增，置显Ｃ进倒微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况、制细胞生长曲线。结果显示，Ｃ绘ＭＳｓ为贴壁生长
（．ｉｌｅｉａｏｌｇ，ｒｈｓ１ＡｎｍａＭｄｃｌＣｌｅＮｏｔｗｅｔＡ＆ＦＵｎｖｒｉｙＹａｇｉｇ７１０Ｃｉａｅｉｅｓｔ，ｎｌ２，ｈｎｎ１０
２ＣｌｇｆＡｎｍａｓａｄｙａｄＶｅｅｉａｙＭｅｉｉｅＨｅａｒｕｔｒｌＵｎｖｒｉ，ｈｎｚｏ５０２Ｃｉａ．ｏｌｅｏｉｌｅＨｕｂｎｒｎｔｒｒｄｃ，ｎｎＡｇｉｌａｎｎｃｕｉｅｓｔＺｅｇｈｕ４００，ｈｎ）ｙ
Ａｂｔａｔｎｔｉｔｙ，ａｆｅｔｖｔｏｏｐｅａｅａｕｔｅｒｂｔｂｏａｒｗｅｉｅｓｒｃ：Ｉｈｓｓｕｄｎｅｆｃｉｅｍｅｈｄｔｒｐｒｎｄｃｌｕｒａｂｉｎｅｍｒｏｄｒｖｄｍｅｅｈｙｌｓｅｃｌｓ（Ｓ）ｗａｓａｌｓｄＡｆｅｈｅｓｎｃｍａｔｍｅｌＭＣｓｓｅｔｂｉｈｅ．ｔｒｔｅｆｍｕｒｒｓｅｔｄｆｏｒｂｂｔｓｗｅｅｄｉｓｃｅｒｍａｉ，ｔｒｏｗａｌｓｄＯｔｈｅｍａｒｗｓｆｕｈｅＵｔｗｉｈＤＭＥＭｄｕｕｅｓｐｔｃｃｎｄｔｏｍｅｉｍｎｄｒａｅｉｏｉｉｎ．ＴｈｅＭＳｒｎＣｓｗｅｅｅ — ｒｃｄａｄｅｐａｅｉｇｂｅｍａｒｗｄｒｎｔｃｌｕｒｉｈｅｎｘｎｄｄｂｙｕｓｎｏｎｒｏａｈｅｅｕｔｅ，ａｎｖｒｅｉｒｃｅｗａｍ — ｎｄｉｅｔｄｍｃｏｓｏｐｓｅｐｏｄｔｓｒｅｔｒｉｅａｉｎａｈｅｒｍｏｐｕｆｐｒｍａｙａｓａｅｃｌｓＴｈｅｒｓｌｌｙｅＯｏｂｅｖｈｅｐｏｌｒｔｏｎｄｔｉｒｈｏｓｏｉｒｎｄｐａｓｇｅｌ．ｆｅｕｔｓｗｓｔａＳＣｓａｅａｈｅｅｅｌｔｉｌｒｆｂｒｂｌｓｏｄｓｎｄｅｓａｄｍｏｐｈｌｙｄｕｉｇｈｏｈｔＭｒｄｒｎｔｃｌｓｗｉｈａｓｍｉａｉｏａｔｉｐｉｌ～ｈｐｅｒｏｏｇｒｎｄｉｆｒｎｐｓａｅ．Ｂｏｎｍａｒｗａｈｅｅｃｌｕｅａｂｕｓｄｏｒｄｕｃｃｒａｎｆｅｅｔａｓｇｓｅｒｏｄｒｎｔｕｔｒｃｎｅｅｔｐｏｅａｅｔｉｐｕｉｙｆｒｔｏ