人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养
(完整)胎盘间充质干细胞的分离和培养 2016.07.21
胎盘间充质干细胞的分离，原代与继代培养及鉴定刘亭2016.7。
21目录前言 (2)1分离制备PMSC组织的选取 (4)2脐带，胎盘MSC的分离与纯化 (6)2.1胎盘组织的获取，存储与清洗 (6)2-2 脐带，胎盘MSC的分离及纯化方法 (7)3 原代培养和继代培养 (11)3—1培养基 (11)3-2培养密度 (12)3-3培养条件 (13)3—4换液 (13)3—5 传代培养 (13)3—6细胞形态与生长速度 (14)3—7 MSC的冻存与复苏： (14)4细胞表面抗原检测 (14)5生长曲线 (15)6细胞周期 (15)7分化潜能 (15)参考文献 (15)附件1不同实验室从脐带血,脐带和胎盘等各组织中分离MSC的方法.. 16脐带血 (16)脐带 (17)羊膜 (19)绒毛膜 (19)蜕膜层 (20)胎盘 (21)整体灌注法 (22)附件2 背景知识 (22)附件3 PMSC实验所需试剂 (23)前言干细胞（Stem cell，SC）是一种能够自我更新且未分化并可分化成两个或两个以上其它品系的细胞。
在一定的条件下，干细胞能够分化成为多种成熟细胞类型。
按照来源和分化潜能不同，干细胞可分为胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESC）和成体干细胞(Adult stem cell，ASC）两类。
胚胎干细胞来源于早期的胚泡和胚胎内层的细胞群，并且具有向3个胚层细胞分化的能力.但是胚胎干细胞应用时产生的免疫排斥、体内实验中引发肿瘤生成以及所涉及的伦理问题等影响并制约了临床应用。
成体干细胞形成于原肠胚形成后的胎儿和成体组织,早期研究认为，成体干细胞主要分化为其来源组织的细胞类型。
然而，近几年来的很多研究表明，成体干细胞具有能够分化成为除来源以外的其他胚层组织的能力。
间充质干细胞(Mesenchymal stem cell， MSC）又称为基质干细胞，是属于成体干细胞的一种，最早从骨髓中分离而来。
一种新的人胚胎干细胞自身来源的滋养层支持其体外培养
一种新的人胚胎干细胞自身来源的滋养层支持其体外培养1安世民*，曾桥*，滕祥云，龙志高，李娟，潘乾，邬玲仟，梁德生，夏昆，夏家辉，张灼华中南大学医学遗传学国家重点实验室, 长沙（410078）E-mail: nlmglcy@摘要：通过人胚胎干细胞（human embryonic stem cells, hESCs）经体内分化获取间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)为人胚胎干细胞提供一种新的滋养层。
将约5×106个hESCs注射入重症免疫联合缺陷小鼠形成畸胎瘤，8周后再从畸胎瘤中分离MSCs并鉴定，将MSCs作为hESCs的滋养层细胞，并检测和观察hESCs的生长情况、细胞特性和分化能力。
从畸胎瘤中获得了纯度较高的具有类似骨髓来源的MSC特性的细胞群，其形态相似、表面抗原标志相似(CD34和CD45阴性，CD29、CD49b、CD105、CD73和CD90阳性)，经诱导可以向成骨细胞和成脂细胞分化。
将hESCs在MSCs滋养层细胞上传代培养10代以上，hESCs依然具有正常的细胞形态，反转录PCR证实其特异转录因子Oct4、Nanog的表达，干细胞表面标记SSEA-1显示为阴性，SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81显示为阳性，碱性磷酸酶染色显示为阳性，并且核型正常。
体外EB形成和体内畸胎瘤形成证明了其全能性。
因此来源于hESCs本身的MSCs可以被用来作为支持胚胎干细胞生长并维持其未分化状态的滋养层细胞。
关键词：人胚胎干细胞，间充质干细胞，滋养层中图分类号：Q2-331.引言人胚胎干细胞（human embryonic stem cells, hESCs）来自于早期的囊胚或桑椹胚, 它具有以下两个最重要的特性：全能性和自我更新能力。
该特性使得其在再生医学和器官移植等领域具有潜在的重大意义。
自从1998年美国威斯康星大学的Thomson教授建立世界上第一株胚胎干细胞系到目前为止，在NIH已经注册了70株胚胎干细胞系[1] (/)。
干细胞提取实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在从骨髓中提取间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs），并对其进行初步鉴定，为进一步的实验研究提供细胞来源。
二、实验材料1. 大鼠骨髓：购自动物实验中心，新鲜取材。
2. DMEM/F12培养基：购自Gibco公司。
3. 胎牛血清（FBS）：购自Gibco公司。
4. 0.25%胰蛋白酶：购自Gibco公司。
5. 抗CD29、CD34、CD45抗体：购自BD公司。
6. 流式细胞仪：购自BD公司。
7. 其他试剂：磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、PBS含2%FBS、4%多聚甲醛等。
三、实验方法1. 骨髓采集：将大鼠麻醉后，无菌操作下取出髌骨，用剪刀剪成小块，置于含有PBS的离心管中，充分漂洗后，用镊子将骨髓组织分离出来。
2. 骨髓细胞消化：将分离出的骨髓细胞用PBS洗涤2次，加入0.25%胰蛋白酶消化5分钟，再用PBS终止消化。
3. 骨髓细胞计数：将消化后的细胞用PBS洗涤2次，调整细胞浓度至1×10^6个/mL。
4. 骨髓细胞培养：将骨髓细胞接种于DMEM/F12培养基中，添加10%FBS，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。
5. 细胞传代：当细胞贴壁生长至80%左右时，用0.25%胰蛋白酶消化，传代至新的培养瓶中。
6. 细胞鉴定：取第3代细胞，用抗CD29、CD34、CD45抗体进行流式细胞仪检测，分析细胞表型。
四、实验结果1. 骨髓细胞在培养箱中贴壁生长，形态呈梭形。
2. 流式细胞仪检测结果显示，骨髓细胞表达CD29、CD34，不表达CD45。
3. 骨髓细胞表现出典型的间充质干细胞表型。
五、实验结论本实验成功从大鼠骨髓中提取了间充质干细胞，并通过流式细胞仪检测验证了其表型。
这为后续的实验研究提供了可靠的细胞来源。
六、实验讨论1. 骨髓是MSCs的重要来源之一，具有来源丰富、易于获取等优点。
2. 本实验采用胰蛋白酶消化法分离骨髓细胞，操作简便，细胞活力较高。
小鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养和鉴定方法学探讨
２ ０ １ ３年 ４月
第１ ７卷
第４
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６ ４７ ・ － — — —
文章编号 ： １ ０ ０ ７ —４ ２ ８ ７ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ４ —０ ６ ４ ７ —０ ４ ．
小 鼠骨 髓 间充 质 干 细胞 的体 外 分 离 培 养 和 鉴 定方 法 学 探讨
无 菌条 件 下 分 离 处 死 后 取 小 鼠双 下 肢 骨 ， 低糖 Ｄ ＭＥ Ｍ 培 养 液 冲 出骨 髓 ， 离心 ５ ａｉ ｒ ｎ ｓ ， 用５ ｍｌ 含 １ Ｏ
胎 牛 血 清 的低 糖 ＤＭＥ Ｍ 培养液重悬 细胞。加入等体积密度为 １ ． ０ ７ ３ ｇ ／ Ｉ ｐ ｅ ｒ ｃ ｏ ｌ １ 分离液离心 ３ ０ ｍｉ ｎ ｓ 。取 中层 云雾 状 细 胞 。３ ７ ℃、 ５ Ｃ Ｏ 培 养箱 中 贴 壁 培 养 。取 ５ ～ １ Ｏ代 细 胞 培 养 至 对 数 生 长期 后 ， 洗 涤 离 心 。取 １ ０ ０ ｌ 细 胞 悬 液 分 别 加
Ｇ ｕ ａ ｎ ｇ — ｙ ｕ ｅ 。 Ｃ ＨＥＮ Ｓ ｕ — ｐ ｉ ｎ ｇ ， ＤＩ ＮＧ Ｊ ｕ ｎ — ｌ ｉ ， ｅ ｔ ａ １ ． （ １ ． Ｄｅ ｐ ａ ｔ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ， ２ ． Ｄｅ ｐ ａ ｔ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｐ ａ ｔ ｈ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ Ｐ
ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ， ｆ ｉ ｎ ｄ ａ ｂｅ ｔ ｔ ｅ ｒ ｃ ｅ ｌ ｌ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｃ ｏｎ ｄｉ ｔ ｉ ｏｎ ｔ ｏ ｓ ａ ｔ ｉ ｓ ｆ ｙ ｔ ｈｅ ｉ ｒ ｑｕ ａ ｌ ｉ ｔ ｙ ａ ｎｄ ｑｕ ａ ｎｔ ｉ ｔ ｙ ． Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄｓ Ｔ ｈｅ ｍｉ ｃ ｅ ｗｅ ｒ ｅ ｋｉ ｌ ｌ ｅ ｄ ｕ ｎ—
贴壁培养与悬浮培养的区别
6 生长过程
潜伏期：悬浮,胞质回缩, 全部细胞 变为圆球形。贴附底物。有运动活 动,基本无增殖, 少见分裂相。 指数增长期：是细胞增生最活跃、 活力最旺盛的阶段培养物中细胞数 量呈指数增长,细胞群体均一。 停滞期：细胞数量达饱和密度后， 细胞遂停止增殖，进入停滞期。
7 传代培养
贴壁细胞 酶消化法传代：弃去培养液，加胰酶消化，加培 养液终止胰酶作用，离心，去上清，吹打成悬液， 分装传代。 悬浮细胞 离心法传代：离心，弃上清液，加新鲜培养基， 分装传代。 直接传代法：待细胞沉淀，倾去1/3-2/3培养液， 用吸管吹打形成细胞悬液再传代。
贴壁培养
悬浮培养
适合包括原代细胞在内的大多数细胞类 型
适合已适应悬浮培养的细胞以及其他一 些无粘附性的细胞
需要定期传代，但是易于通过倒置显微 镜观察。显微镜下观察形态多种。晃动 培养液时，细胞不动 利用酶或机械方法解离细胞 需要使用经过组织培养处理的容器
较易传代，但是需要每天进行细胞计数 和存活率测定。显微镜下观察呈圆形。 晃动培养液时，细胞也随着漂动 无需通过酶或机械方法解离细胞 可使用未经组织培养处理的容器，但需 进行搅动以便进行充分的气体交换 可批量收获产物，用于蛋白质的大量生 产及多种研究领域
可连续收获产物，用于细胞学研究等多 种研究领域
细胞生长受表面积限制
细胞生长受培养基中浓度的限制
悬浮细胞培养
温度
植物悬浮细胞系：23-27℃
pH
哺乳动物系：7.0-7.4 成纤维细胞系：7.4-7.7
植物细胞：5.6-6.0
培养基
需血清
悬浮培养基可不需血清
5 细胞形态
贴壁培养细胞：成纤维细胞型 上皮细胞型 游走细 胞型 多型细胞型 悬浮培养细胞：悬浮型
骨髓间充质干细胞研究与应用概况
骨髓间充质干细胞研究与应用概况于雷;高俊玲【摘要】骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal cells,BMSCs)是当下热点研究对象之一。
1867年德国病理学家Cohnheim教授[1]在研究创口愈合过程中发现骨髓中存在一种非造血系统的多潜能细胞,但研究因为条件原因未能深入。
后来有研究者[2]在20世纪60年代开展一系列开创性研究,发现从骨髓中分离得到长梭状、成纤维细胞样的细胞群,在塑料培养皿中呈集落样贴壁生长;1987年,又发现这种骨髓单核细胞可在一定的条件下分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞。
培养增殖二十代后仍保有其多向分化的潜能。
于是把这种多能细胞称为间充质干细胞(mesenchyma stem cell,MSC)。
【期刊名称】《华北理工大学学报：医学版》【年(卷),期】2018(020)002【总页数】5页(P164-168)【关键词】骨髓间充质干细胞;肺纤维化;缺血性脑卒中【作者】于雷;高俊玲【作者单位】[1]华北理工大学基础医学院,河北唐山063000;[1]华北理工大学基础医学院,河北唐山063000;【正文语种】中文【中图分类】R329.2骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal cells，BMSCs)是当下热点研究对象之一。
1867年德国病理学家Cohnheim教授[1]在研究创口愈合过程中发现骨髓中存在一种非造血系统的多潜能细胞，但研究因为条件原因未能深入。
后来有研究者[2]在20世纪60年代开展一系列开创性研究，发现从骨髓中分离得到长梭状、成纤维细胞样的细胞群，在塑料培养皿中呈集落样贴壁生长；1987年，又发现这种骨髓单核细胞可在一定的条件下分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞。
培养增殖二十代后仍保有其多向分化的潜能。
于是把这种多能细胞称为间充质干细胞(mesenchyma stem cell，MSC)。
芍药苷-是中药芍药的主要有效成分,是一种单萜类糖苷化合物,具有多种生物活性
芍药苷-是中药芍药的主要有效成分，是一种单萜类糖苷化合物，具有多种生物活性芍药苷-是中药芍药的主要有效成分，是一种单萜类糖苷化合物，具有多种生物活性，如抗氧化、抗自由基损伤、抗血小板聚集、改善微循环、免疫调节等，且毒副作用小。
芍药苷作为白芍总苷的主要成分，已被广泛应用于类风湿关节炎的临床治疗。
学术术语来源——芍药苷对骨髓间充质干细胞增殖的影响文章亮点：1芍药苷作为一种天然活性成分，具有补血及免疫抑制作用，对类风湿关节炎等自身免疫性疾病表现出一定的疗效，但其具体作用机制仍不明确，实验旨在通过观察芍药苷对间充质干细胞增殖及表达细胞因子的作用，从细胞水平探讨芍药苷的补血及免疫调节机制。
2研究发现，芍药苷促进骨髓间充质干细胞增殖的同时，可使骨髓间充质干细胞高表达白细胞介素6基因，并促进其细胞外分泌白细胞介素6。
由此说明，芍药苷或许是通过促进骨髓或外周血中骨髓间充质干细胞的增殖，促使其高分泌白细胞介素6等细胞因子进而影响造血细胞及免疫细胞的功能。
关键词：干细胞；骨髓干细胞；芍药苷；骨髓间充质干细胞；细胞增殖；白细胞介素6主题词：骨髓；间质干细胞；细胞增殖；白细胞介素6摘要背景：研究显示芍药苷具有补血及治疗自身免疫性疾病的功效，骨髓间充质干细胞对机体的造血及免疫功能也起着重要的作用，但芍药苷对骨髓间充质干细胞的增殖及细胞因子的分泌和表达有何影响报道较少。
目的：探讨芍药苷对人骨髓间充质干细胞增殖及白细胞介素6表达的影响。
方法：采用密度梯度离心法和贴壁培养法体外分离培养人骨髓间充质干细胞，用流式细胞术和成脂及成骨诱导法鉴定人骨髓间充质干细胞生物学特性，MTT 法检测不同浓度芍药苷对人骨髓间充质干细胞增殖的影响，ELISA 法测定芍药苷干预人骨髓间充质干细胞后培养上清液中白细胞介素6的分泌水平，RT-PCR 检测芍药苷干预后白细胞介素6 mRNA的表达情况。
结果与结论：成功分离出骨髓间充质干细胞，具有成骨、成脂分化潜能。
银屑病患者骨髓间充质干细胞体外自发向血管内皮细胞分化1例
Ｌ Ｕ Ｒｕ — ｅ ｇ，Ｆ Ｉ ｉ ｆｎ ＥＮＧ Ｈａ— ａ ｉ ｙ ｎ，Ｚ ＨＡＮＧ ｉ ｇ ＹＩ Ｇｕ — ｕ ， Ｚ Ｊ ｎ ， Ｎ ｏ ｈ ａ ＨＡＮＧ ｉ ｍｉ ｇ Ｋａ — ｎ
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骨髓间充质干细胞实验室分离的方法
骨髓间充质干细胞实验室分离的方法秦宏敏;李强;马怀忠;胥毅;龚维成【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2005(009)006【摘要】目的:探讨实验室中简单实用,准确有效的骨髓间充质干细胞的分离方法,为其组织工程的临床应用创造最佳选择.方法:选用1月龄新西兰兔,自胫骨上端抽取骨髓血,分别用Percoll分离液;全血细胞培养法;淋巴细胞分离液以及0.17mol/L氯化铵溶液分离培养兔骨髓间充质干细胞,观察分离细胞的含量以及生物活性.结果:2周后Percoll分离液法细胞含量明显高于全血细胞培养法,淋巴细胞分离液未分离出骨髓间充质干细胞,0.17 mol/L氯化铵溶液12次实验中仅有1次分离出少量细胞. 结论:Percoll分离液和全血细胞培养法为有效的骨髓间充质干细胞分离方法.【总页数】2页(P68-69)【作者】秦宏敏;李强;马怀忠;胥毅;龚维成【作者单位】徐州医学院附属医院骨科,江苏省,徐州市,221002;徐州医学院附属医院骨科,江苏省,徐州市,221002;徐州医学院附属医院骨科,江苏省,徐州市,221002;铜山县第三人民医院骨科,江苏省,铜山县,221124;徐州医学院附属医院骨科,江苏省,徐州市,221002【正文语种】中文【中图分类】R329.2【相关文献】1.小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养新方法 [J], 徐丽娟;张云巍;王淑芳;阎丽2.大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养贴壁分离和消化控制相结合可否为简便高效的技术方法 [J], 刘品端;王伟;梅晰凡3.大鼠骨髓间充质干细胞分离方法的改良与比较 [J], 马逸群;邵丽诗;万珊杉;杨扬;李嘉琦;王家平4.两种骨髓间充质干细胞分离方法的对比研究 [J], 杨雷;朱平;朱烁基;刘健;黄焕雷;郭惠明;陈寄梅;庄建;赵明一;吴秀山5.采用1.068g/ml分离液对犬骨髓间充质干细胞的分离纯化与体外培养方法的探讨 [J], 牛国栋;任晓庆;王方正;浦介麟;杨国胜;孟亮;张澍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
造血细胞分离、集落培养及表型分析
五、实验结果
脐血的体积
样品
分离出的单个 核细胞液的细
胞密度 9.8625×107 个
/mL
表 1 血球计数板计数结果
脐血中单个核 脐血中单个核 脐血中单个核
细胞液体积 细胞液细胞密 细胞液白细胞
度
密度
30mL
3.15×109 个/mL 3.9625×108 个
分离出的单个 核细胞液的白
收率(总细胞)
/mL 收率(白细胞)
细胞密度
5.1×106 个/mL
0.16%
0.064%
分离出的单个 核细胞液的体
积 1.5mL
纯度
12.26%
1、脐血共稀释 10,000 倍，利用血球计数板计数结果如下
38 28
27 34
40 30
16 39
(38+28+27+34+40+30+16+39)÷8=31.5 31.5×10000×104=3.15×109 个/mL
以总细胞计：9.8625×107×1.5÷(3.15×109×30)=0.16%
以白细胞计：5.1×106×1.5÷(3.9625×108×30)=0.064%
6、纯度
3.15×109×60=12.26%
5.2 流式细胞分析结果
5.2.1 流式细胞分析结果图
图 1 C流式细胞分析结果
33 30
25 32
32 24
(47+40+33+30+25+32+32+24)÷8=32.875 32.875×300×104=9.8625×107 个/mL
4、分离裂解后共稀释 30 倍，利用血球计数板计数结果如下
CM-DIL和DAPI标记的骨髓间充质干细胞
CM-DIL和DAPI标记的骨髓间充质干细胞商青青;李凯;周建业;胡盛寿【摘要】背景：在有关“细胞移植”的实验研究中，细胞标记技术被广泛应用。
CM-DIL与DAPI是细胞标记实验中常用的荧光染料，目前两者的对比研究报道较少。
<br> 目的：从体外实验与体内实验两方面，探讨两种荧光染料CM-DIL与DAPI在标记大鼠骨髓间充质干细胞方面的差异。
<br> 方法：用贴壁培养法获取、培养、扩增大鼠骨髓间充质干细胞，分别用CM-DIL与DAPI进行标记，锥虫蓝计数检测骨髓间充质干细胞的活力；MTS法检测骨髓间充质干细胞的增殖能力并绘制增殖曲线；倒置相差荧光显微镜下动态观察标记后1，2，3代骨髓间充质干细胞的荧光衰减情况。
结扎SD大鼠冠状动脉前降支致心肌梗死。
1周后于心肌梗死边缘处注射CM-DIL与DAPI标记的细胞，细胞移植后3 d取材观察骨髓间充质干细胞的分布情况。
<br> 结果与结论：体外实验中，CM-DIL与DAPI标记的骨髓间充质干细胞两者的早期增殖能力均低于对照组；两种染料标记后的第1代细胞的荧光阳性率均为100%，但DAPI标记后的第3代细胞的荧光强度明显减弱。
体内实验中，CM-DIL组与DAPI组心肌组织冰冻与石蜡切片均检测到集中分布的荧光；CM-DIL组冰冻切片红色荧光比DAPI组的蓝色荧光边界清晰并且背景低；CM-DIL组还可以通过含细胞核染色的封片剂封片排除荧光假阳性。
可见，CM-DIL染料比DAPI更适合对骨髓间充质干细胞进行体内示踪。
%BACKGROUND:cellmarker technology has been widely applied in many studies concerning celltransplantation. Chlormethylbenzamido-1,1-dioctadecyl-3,3,3’3’-tetramethylin-docarbocyamine (CM-DIL) and 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) are commonly used for labeling cells. To our knowledge, there are few reports on comparing the two fluorescentdyes. <br> OBJECTIVE:To compare the effects of CM-DIL and DAPI on labeling bone marrow mesenchymal stem cells in vitro and in vivo. <br> METHODS:Isolation and expansion of bone marrow-derived mesenchymal stem cells were performed according to attachment culture. The cells were labeled by CM-DIL and DAPI, respectively. cellviability was assessed via trypan blue exclusion assay. Growth curves of bone marrow-derived mesenchymal stem cells were depicted using MTS assay. The reduction of fluorescent intensity was observed under an inverted fluorescent contrast phase microscope from passage 1 to passage 3 after labeling. Myocardial infarction was induced by left anterior artery ligation in Sprague-Dawley rats. One week later, bone marrow-derived mesenchymal stem cells labeled by CM-DIL or DAPI were injected randomly into the border area of infarct myocardium. After 3 days, transplanted celldistribution was examined under the fluorescent microscope through paraffin sections and frozen sections respectively. <br> RESULTS AND CONCLUSION:In vitro, bone marrow-derived mesenchymal stem cells labeled by both CM-DIL and DAPI showed decreased cellproliferation during the early period;the percentage of fluorescent-positive cells was approximately 100%in the two groups;however, the fluorescent intensity was significantly reduced from passage 1 to passage 3 in bone marrow-derived mesenchymal stem cells labeled by DAPI. In vivo, the transplanted cells were detected in a concentrated way both on the paraffin sections and frozen ones;the background color of frozen sections was lower in the CM-DIL group than in the DAPI group;false positive results of fluorescentexpression could be eliminated in the CM-DIL group by using fluorescent mounting medium with the fluorescence of DNA staining. These data indicates that CM-DIL is more appropriate to in vivo tracing cells than DAPI.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2013(000)045【总页数】6页(P7855-7860)【关键词】干细胞;骨髓干细胞;CM-DIL;DAPI;荧光染料;标记;骨髓间充质干细胞;细胞活力;细胞增殖;心肌梗死;荧光表达;干细胞图片文章【作者】商青青;李凯;周建业;胡盛寿【作者单位】阜外心血管病医院，北京市 100037;阜外心血管病医院，北京市100037;阜外心血管病医院，北京市 100037;阜外心血管病医院，北京市 100037【正文语种】中文【中图分类】R394.20 引言 Introduction在有关细胞移植的实验研究中，细胞标记技术被用来追踪干细胞在宿主体内的去向和命运。
骨髓间充质干细胞的贴壁培养及内毒素对其增殖活性的影响
ｍ Ｐ ｌ Ｓ组 值与其余 各组相 比， Ｌ 具有
全 骨 髓 贴 壁 培 养 法 可 以方 便 、 捷 地 获 得 Ｂ Ｃ ， 在 形 态 学 、 胞 快 ＭＳ ｓ其 细
表面标志物表达和多向分化能力方面具有干细胞生物学特性 ；．１ ｇ ｍ Ｐ Ｏ ０ ／ ｌ Ｓ可明显促进 Ｂ Ｓ ｓ的 Ｌ ＭＣ
Ｈ Ｏ Ｙ ｎｑｎ Ｌ 诫ｇ ＩＨ ， Ｈ Ｏ Ａ ａ — ． Ｕ Ｎ ，Ｌ ｏ Ｚ Ａ ｉ
Ｉｎ ．Ｄ ｐ ｒ ｅｔｆＩ ｅ ｉ ｓＤｓａｅ，ｔ ｉｔＣｉｉ ｌ ｆ ｇ ｅａｔ ｎ ｏ ｎ ｃｏ ｉ ｓ ｈ Ｆｒ ｌ ｃ ｅ ｍ ｆ ｔｕ ｅ ｓ ｅ ｓ ｎａ
Ｍ ｅ ｃ ｌｅ ｄｉａｌＣｏ ｌｇｅ，Ｓ ａｎ ｉＭ ｅ ｉａ ｉｅｓｔ ｈ ｘ ｄｃ ｌＵｎｖ ｒｉ ｙ，Ｔａｙ ｎ ０ ０ ｌｕａ ３０ ０１， ｎ Ｃｈｉａ
郝彦 琴 卢宁 李红 赵龙凤
【 摘要 】 目的 贴壁法分离培养 大鼠骨髓 问充质干细胞 （ ＭＳ ｓ ， Ｂ Ｃ ） 并观 察不 同浓度 内毒 素对其
采 用 全 骨 髓 贴 壁 培 养 法 培养 大 鼠 Ｂ Ｃ ， 置 微 镜 下 观 察 细 胞 形 态 ， 疫 ＭＳ ｓ倒 免 ｍ 、 ｇ ｍ 、０ ｌ１ ／ ｌ１ ｍ 、０ ｌ１０ ｍ１ 作 用 ２ ， 四 唑 盐 比 色 法 （ ｌ ） 测 ） ４ｈ 用 Ｍｒ 检 Ｔ ｒ
增 殖 活性 的影 响 。方 法 （ 、． １ ｇｍ 、． ０ ０ ０ ／ ｌ０ １ Ｂ Ｓ ｓ 增殖。结果 ＭＣ的
细胞化学方法检测细胞 Ｃ ４ 、 Ｄ ９ Ｃ ３ Ｄ ４ Ｃ ２ 、Ｄ ４的表达 ， 流式 细胞 术检测细胞周期 。加 不同浓度 的内毒素
分 离 培 养 的细 胞 三 代 以 后 呈 均 一 的成 纤 维 细 胞 样 形 态 ， 表 达 Ｃ ４ 但 不 表 高 Ｄ ４，
全骨髓贴壁法培养兔骨髓间充质干细胞体外定向成骨诱导分化及鉴定
（ ２ ０ １ ３ ） ０ ６ — ０ １ ０ ６ ９ － ０ ６
收稿 日期：２ ０ １ ２ ． ０ ５ ． １ ９
修回日 期 ：２ ０ １ ２ ． ０ ６ ． １ ６
【 ２ ０ １ ２ ０ ３ １ ９ ０ ２ ３ ／ Ｗ‘ Ｃ）
／ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ ｏ ｓ ｔ ｅ ｏ ｇ ｅ ｎ ｉ ｃ ｄ ｉ ｆ ｅ ｒ ｅ ｎ ｔ ｉ ａ ｔ ｉ ｏｎ ａ ｎ ｄ ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏｎ ｏ ｆ ｒ ａ ｂ ｂｉ ｔ ｂ ｏｎ ｅ ｍａ ｒ ｒ ｏ ｗ
方法 ：采用 全骨 髓贴 壁法 体外 分离 培养 兔骨 髓 间充质 干 细胞 ，倒置 显微 镜下 观察 细胞 形态 学特 征 。在成
科大学第一附属 医院创伤 手 外 科 ，广 西壮 族 自治 区
南 宁市 ５ ３ ０ ０ ２ １
ｗ ｅ ｊ ｑ ｉ ｎ ｇ ｊ ｕ ｎ ｇ ｘ ｎ ｎ ＠
１ ６ ３． ｃ ｏｍ
ｄ ｏ ｋ ｌ Ｏ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． ２ ０ ９ ５ － ４ ３ ４ ４ ． ２ ０ １ ３ ， ０ ６ ． ０ ２ ０ 中国组织Ｉ程磷究 ． ２ ０ １ ３ ，１ ７ （ ６ ） ： １ ０ ６ ９ － １ ０ ７ ４ ，
ｍｔ ｌ ｐ ： ｆ Ｗ ｗ ｗ ． ｃ ｒ 【 ｅ ｒ ｏ 固 １
中图分类号： Ｒ ３ ９ ４ ２ 文献标识码： Ｂ 文章编号： ２ ０ ９ ５ － ４ ３ ４ ４
骨诱 导剂 作 用 下 ，通 过 碱 性 磷 酸 酶 染色 试 剂 盒 行 碱 性 磷 酸 酶染 色 ， Ｉ型胶 原 免 疫 细 胞 化 学 染 色 ，Ｙ ｏ ｎ Ｋ ｏ ｓ ｓ ａ法 及 茜素 红进行 矿化 结节 染色 以及 电镜 下 检测 兔骨髓 问充质 干细 胞成 骨诱 导 后 的形态 结构 。 结果 与结 论 ： 经诱 导后 细胞 出现 与成 骨细 胞相 似 的形态 学特 征 ， 碱 性磷 酸酶 染色 阳性 ， Ｉ 型胶 原 免疫 细胞 化 学染 色 ， Ｙ ｏ ｎ － Ｋ ｏ ｓ ｓ ａ法 及茜 素红 矿化 结节 染色 阳 性 。 表 明经 成骨 诱导 剂 诱导 后全 骨髓 贴壁 法体 外分 离 纯化 培养 的兔骨 髓 间充 质干 细胞 能 向成 骨 细胞 方 向分化 增殖 。
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Ｚｈａ ｏ Ｌｉｎｇ－ｙｕｎ， Ｔｅ ｃｈｎｉｃｉａ ｎ， Ｄｅ ｐａ ｒｔｍｅ ｎｔ ｏｆ Ｓ ｐｉｎａ ｌ Ｃｏｒｄ Ｒｅ ｐａ ｉｒｉｎｇ， Ｇｅ ｎｅ ｒａ ｌ Ｈｏｓ ｐｉｔａ ｌ ｏｆ Ｊ ｉｎａ ｎ Ｍｉｌｉｔａ ｒｙ Ａｒｅ ａ Ｃｏｍｍａ ｎｄ ｏｆ Ｃｈｉｎｅ ｓ ｅ Ｐ ＬＡ， Ｊ ｉｎａ ｎ ２５００３１， Ｓ ｈａ ｎｄｏｎｇ Ｐ ｒｏｖｉｎｃｅ ， Ｃｈｉｎａ ｚｈａ ｏｌｉｎｇｙｕｎ８０１１２２＠ １６３．ｃｏｍ
摘要 目的： 验证贴壁方式分离人骨髓间充质干细胞， 并进行体外扩增培养的可行性。 方法： 实验于 ２００６－ ０２／１２ 在解放军济南军区总医院脊髓修复科完成。①实验材料： 骨髓来源于解放军济南军区总医院脊髓修 复科收治的脊髓完全性损伤患者， 对本实验知情同意。基础培养液由含体积分数为 ０．１５ 胎牛血清和低糖 α－ＭＥＭ 配置。②实验 方法： 无菌条件下髂后上棘穿刺抽取骨髓组织 ６ ｍＬ， 进行细胞培养， 观察细胞生长情况， 待细胞融合成片、长满培养瓶底部后， 用质量浓度为 ２．５ ｇ／Ｌ 的胰蛋白酶流过所有细胞表面。倒置显微镜下观察细胞变圆、部分脱壁后， 立即加入有血清培养液终止消 化。③实验评估： 取第 ３ 代生长状态良好的细胞， 胰蛋白酶消化制成细胞悬液， 接种， 以细胞数为纵坐标， 时间为横坐标， 绘制细 胞生长曲线。同时每隔 ２ ｈ 进行细胞贴壁率检测。 结果： ①骨髓间充质干细胞的形态学观察： 倒置显微镜下， 骨髓间充质干细胞接种 １ ｄ 即贴壁， 去除悬浮细胞后继续培养 ３ ｄ 贴 壁细胞开始增殖， 伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等。至 １４ ｄ 细胞密集在集落中心， 基本铺满瓶底， 第 ３～５ 代细胞呈 均匀一致的长梭型， 排列成旋涡状或放射状。②骨髓间充质干细胞的生长曲线： 细胞传代后 ３ ｄ 内处于潜伏期， ３ ｄ 后进入生长 期， ７ ｄ 后进入平台期。③骨髓间充质干细胞的贴壁率： 随着培养时间的延长， 骨髓间充质干细胞贴壁率逐渐升高。传代后 ２， ４， ６， ８， １０， １２， １４， １６， １８， ２０ ｈ 细胞贴壁率分别为 （ ２０．２０±０．２５） ％ ， （ ３３．００±０．２９） ％ ， （ ４６．５０±０．３２） ％ ， （ ６９．２０±０．３０） ％ ， （ ７６．６０± ０．３４） ％， （ ８６．５０±０．２７） ％， （ ９０．３０±０．２０） ％， （ ９６．１０±０．２８） ％， （ ９８．５０±０．１２） ％， （ ９９．００±０．０７） ％。 结论： 贴壁法分离骨髓间充质干细胞操作简便， 经体外扩增培养后细胞增殖活性强， 传代周期为 ７ ｄ， 是比较理想的骨髓间充质 干细胞培养方法。 关键词： 骨髓间充质干细胞； 贴壁； 分离培养； 细胞活性
中国组织工程研究与临床康复 第 １１ 卷 第 ２８ 期 ２００７－ ０７－ １５ 出版 Ｊ ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｖｅ Ｔｉｓ ｓ ｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓ ｅａｒｃｈ Ｊ ｕｌｙ １５， ２００７ Ｖｏｌ．１１， Ｎｏ．２８
临床医学
人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养
ＣＲＴＥＲ
赵凌云， 钱淑琴， 赵廷宝
Ａｄｈｅｒ ｅｎｔ ｓｅｐａｒ ａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒ ｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒ ｒ ｏｗ－ｄｅｒ ｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ
Ａｂｓｔｒ ａｃｔ ＡＩＭ： Ｔｏ ｉｎｖｅ ｓ ｔｉｇａ ｔｅ ｔｈｅ ｆｅ ａ ｓ ｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｓ ｅ ｇｒｅ ｇａ ｔｉｎｇ ａ ｎｄ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｂｏｎｅ ｍａ ｒｒｏｗ－ｄｅ ｒｉｖｅ ｄ ｍｅ ｓ ｅ ｎｃｈｙｍａ ｌ ｓ ｔｅ ｍ ｃｅ ｌｌｓ （ＭＳ Ｃｓ ） ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ａ ｄｈｅ ｒｅ ｎｃｅ ｍｅ ｔｈｏｄ． ＭＥＴＨＯＤＳ： Ｔｈｅ ｅ ｘｐｅ ｒｉｍｅ ｎｔ ｗａ ｓ ｃｏｎｄｕｃｔｅ ｄ ａ ｔ Ｄｅ ｐａ ｒｔｍｅ ｎｔ ｏｆ Ｓ ｐｉｎａ ｌ Ｃｏｒｄ Ｒｅ ｐａ ｉｒｉｎｇ， Ｇｅ ｎｅ ｒａ ｌ Ｈｏｓ ｐｉｔａ ｌ ｏｆ Ｊ ｉｎａ ｎ Ｍｉｌｉｔａ ｒｙ Ａｒｅ ａ Ｃｏｍｍａ ｎｄ ｏｆ Ｃｈｉｎｅ ｓ ｅ Ｐ ＬＡ ｆｒｏｍ Ｆｅ ｂｒｕａ ｒｙ ｔｏ Ｄｅ ｃｅ ｍｂｅ ｒ ２００６． ① Ｔｈｅ ｂｏｎｅ ｍａ ｒｒｏｗ ｗａ ｓ ｄｅ ｒｉｖｅ ｄ ｆｏｒｍ ｐａ ｔｉｅ ｎｔｓ ｓ ｕｆｆｅ ｒｅ ｄ ｆｒｏｍ ｆｒａ ｃｔｕｒｅ ｄｉｓ ｌｏｃａ ｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｓ ｐｉｎａ ｌ ｃｏｒｄ ｄａ ｍａ ｇｅ ｄ ｃｏｍｐｌｅ ｔｅ ｌｙ， ｗｈｏ ｗｅ ｒｅ ｔｒｅ ａ ｔｅ ｄ ａ ｔ Ｄｅ ｐａ ｒｔｍｅ ｎｔ ｏｆ Ｓ ｐｉｎａ ｌ Ｃｏｒｄ Ｒｅ ｐａ ｉｒｉｎｇ， Ｇｅ ｎｅ ｒａ ｌ Ｈｏｓ ｐｉｔａ ｌ ｏｆ Ｊ ｉｎａ ｎ Ｍｉｌｉｔａ ｒｙ Ａｒｅ ａ Ｃｏｍｍａ ｎｄ ｏｆ Ｃｈｉｎｅ ｓ ｅ Ｐ ＬＡ， ａ ｎｄ ｃｏｎｓ ｅ ｎｔｅ ｄ ｔｏ ｔｈｉｓ ｅ ｘｐｅ ｒｉｍｅ ｎｔ． Ｆｕｎｄａ ｍｅ ｎｔａ ｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓ ｏｌｕｔｉｏｎ ｃｏｍｐｒｉｓ ｅ ｄ ｆｅ ｔａ ｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓ ｅ ｒｕｍ ｗｉｔｈ ｖｏｌｕｍｅ ｆｒａ ｃｔｉｏｎ ｏｆ ０．１５ ａ ｎｄ ｌｏｗ ｃａ ｒｂｏｈｙｄｒａ ｔｅ ｓ α－ＭＥＭ． ②６ ｍＬ ｂｏｎｅ ｍａ ｒｒｏｗ ｗａ ｓ ｉｓ ｏｌａ ｔｅ ｄ ｓ ｔｅ ｒｉｌｅ ｌｙ ｆｒｏｍ ｐｏｓ ｔｅ ｒｉｏｒ ｓ ｕｐｅ ｒｉｏｒ ｉｌｉａ ｃ ｓ ｐｉｎｅ ｆｏｒ ｃｅ ｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ． Ｃｅ ｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｗａ ｓ ｏｂｓ ｅ ｒｖｅ ｄ ｕｎｔｉｌ ｃｅ ｌｌｓ ｃｏａ ｌｅ ｓ ｃｅ ｄ ａ ｎｄ ｃｏｖｅ ｒｅ ｄ ｔｈｅ ｂｏｔｔｏｍ ｏｆ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｌａ ｓ ｋ ｔｈｅ ｃｅ ｌｌｓ ｗｅ ｒｅ ｉｎｆｉｌｔｒａ ｔｅ ｄ ｂｙ ｔｒｙｐｓ ｉｎ ｗｉｔｈ ｃｏｎｃｅ ｎｔｒａ ｔｉｏｎ ｏｆ ２．５ ｇ／Ｌ． Ｆｕｎｄａ ｍｅ ｎｔａ ｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓ ｏｌｕｔｉｏｎ ｗａ ｓ ａ ｄｄｅ ｄ ｔｏ ｔｅ ｒｍｉｎａ ｔｅ ｃｏｎｃｏｃｔｉｏｎ ｗｈｅ ｎ ｃｅ ｌｌｓ ｔｕｒｎｅ ｄ ｉｎｔｏ ｃｉｒｃｌｅ ａ ｎｄ ｄｅ ｔａ ｃｈｅ ｄ ｐａ ｒｔｌｙ． ③Ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｇｅ ｎｅ ｒａ ｔｉｏｎ ｗｅ ｌｌ－ｇｒｅ ｗ ｃｅ ｌｌｓ ｗｅ ｒｅ ｄｉｇｅ ｓ ｔｅ ｄ ｉｎｔｏ ｃｅ ｌｌ ｓ ｕｓ ｐｅ ｎｓ ｉｏｎ ａ ｎｄ ｉｎｏｃｕｌａ ｔｅ ｄ． Ｃｅ ｌｌｓ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ ｗａ ｓ ｄｒａ ｗｎ ｔａ ｋｉｎｇ ａ ｍｏｕｎｔ ｏｆ ｃｅ ｌｌｓ ａ ｓ Ｙ－ａ ｘｉｓ ａ ｎｄ ｔｉｍｅ ａ ｓ Ｘ－ａ ｘｉｓ ． Ｓ ｉｍｕｌｔａ ｎｅ ｏｕｓ ｌｙ， ａ ｄｈｅ ｓ ｉｏｎ ｒａ ｔｅ ｗａ ｓ ｄｅ ｔｅ ｒｍｉｎｅ ｄ ｅ ｖｅ ｒｙ ２ ｈｏｕｒｓ ． ＲＥＳＵＬＴＳ： ①Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａ ｌ ｏｂｓ ｅ ｒｖａ ｔｉｏｎ ｏｆ ＭＳ Ｃｓ ： Ｕｎｄｅ ｒ ｉｎｖｅ ｒｔｅ ｄ ｍｉｃｒｏｓ ｃｏｐｅ ， ｔｈｅ ＭＳ Ｃｓ ｂｅ ｇａ ｎ ｔｏ ａ ｄｈｅ ｒｅ ｔｏ ｔｈｅ ｗａ ｌｌ ａ ｔ ｄａ ｙ １． ＭＳ Ｃｓ ｂｅ ｇａ ｎ ｔｏ ｐｒｏｌｉｆｅ ｒａ ｔｅ ａ ｎｄ ｂｅ ｃｏｍｅ ｉｎｔｏ ｅ ｌｌｉｐｓ ｅ ， Ｆｕｓ ｉｆｏｒｍ ｓ ｈａ ｐｅ ， ｐｏｌｙｇｏｎ ａ ｎｄ ｉｒｒｅ ｇｕｌａ ｒｉｔｙ ａ ｔ ｄａ ｙ ３． ＭＳ Ｃｓ ｃｏｎｃｅ ｎｔｒａ ｔｅ ｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅ ｎｔｅ ｒ ｏｆ ｃｏｌｏｎｙ ａ ｎｄ ｃｏｖｅ ｒｅ ｄ ｔｈｅ ｂｏｔｔｏｍ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｌａ ｓ ｋ ａ ｔ ｄａ ｙ １４． Ｔｈｅ ３ｒｄ－ ５ｔｈ ｇｅ ｎｅ ｒａ ｔｉｏｎ ＭＳ Ｃｓ ｐｒｅ ｓ ｅ ｎｔｅ ｄ ｌｏｎｇ－ｆｕｓ ｉｆｏｒｍ ｓ ｈａ ｐｅ ａ ｎｄ ａ ｒｒａ ｎｇｅ ｄ ｉｎｔｏ ｗｈｉｒｌｐｏｏｌ ｏｒ ｒａ ｄｉａ ｔｉｏｎ． ②Ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ＭＳ Ｃｓ ： ＭＳ Ｃｓ ｗｅ ｒｅ ｉｎ ｌａ ｔｅ ｎｃｙ ｉｎ ３ ｄａ ｙｓ ， ｃｏｎｖｅ ｒｔｅ ｄ ｉｎｔｏ ｇｒｏｗｉｎｇ ｐｅ ｒｉｏｄ ａ ｆｔｅ ｒ ３ ｄａ ｙｓ ａ ｎｄ ｅ ｎｔｅ ｒｅ ｄ ｉｎｔｏ ｓ ｔａ ｔｉｏｎａ ｒｙ ｐｈａ ｓ ｅ ｓ ａ ｆｔｅ ｒ ７ ｄａ ｙｓ ． ③Ａｄｈｅ ｒｅ ｎｃｅ ｒａ ｔｅ ｏｆ ＭＳ Ｃｓ ： Ｔｈｅ ａ ｄｈｅ ｒｅ ｎｃｅ ｒａ ｔｅ ｉｎｃｒｅ ａ ｓ ｅ ｄ ｇｒａ ｄｕａ ｌｌｙ ｗｉｔｈ ｔｉｍｅ ｇｏｅ ｓ ｂｙ． Ｔｈｅ ａ ｄｈｅ ｒｅ ｎｃｅ ｒａ ｔｅ ｓ ｗｅ ｒｅ （ ２０．２０±０．２５） ％ ， （ ３３．００± ０．２９） ％ ， （ ４６．５０ ±０．３２） ％ ， （ ６９．２０ ±０．３０） ％ ， （ ７６．６０ ±０．３４） ％ ， （ ８６．５０ ±０．２７） ％ ， （ ９０．３０ ±０．２０） ％ ， （ ９６．１０ ±０．２８） ％ ， （ ９８．５０ ± ０．１２） ％， （ ９９．００±０．０７） ％， ｒｅ ｓ ｐｅ ｃｔｉｖｅ ｌｙ ａ ｔ ２， ４， ６， ８， １０， １２， １４， １６， １８ ａ ｎｄ ２０ ｈｏｕｒｓ ａ ｆｔｅ ｒ ｐａ ｓ ｓ ａ ｇｅ ． ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ： Ｔｈｅ ａ ｄｈｅ ｒｅ ｎｃｅ ｓ ｅ ｐａ ｒａ ｔｉｏｎ ｍｅ ｔｈｏｄ ｃａ ｎ ｂｅ ｍａ ｎｉｐｕｌａ ｔｅ ｄ ｃｏｎｖｅ ｎｉｅ ｎｔｌｙ， ａ ｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅ ｒａ ｔｉｖｅ ａ ｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｅ ｌｌｓ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｓ ｓ ｔｒｏｎｇ ｗｉｔｈ ｐｅ ｒｉｏｄ ｏｆ ７ ｄａ ｙｓ ． Ｉｔ ｉｓ ａ ｎ ｉｄｅ ａ ｌ ｍｅ ｔｈｏｄ ｔｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ＭＳ Ｃｓ ．
Ｃｏｒｒｅ ｓ ｐｏｎｄｅ ｎｃｅ ｔｏ：
Ｚｈａ ｏ Ｔｉｎｇ－ｂａ ｏ，