人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养

Ｚｈａ ｏ Ｌｉｎｇ－ｙｕｎ， Ｔｅ ｃｈｎｉｃｉａ ｎ， Ｄｅ ｐａ ｒｔｍｅ ｎｔ ｏｆ Ｓ ｐｉｎａ ｌ Ｃｏｒｄ Ｒｅ ｐａ ｉｒｉｎｇ， Ｇｅ ｎｅ ｒａ ｌ Ｈｏｓ ｐｉｔａ ｌ ｏｆ Ｊ ｉｎａ ｎ Ｍｉｌｉｔａ ｒｙ Ａｒｅ ａ Ｃｏｍｍａ ｎｄ ｏｆ Ｃｈｉｎｅ ｓ ｅ Ｐ ＬＡ， Ｊ ｉｎａ ｎ ２５００３１， Ｓ ｈａ ｎｄｏｎｇ Ｐ ｒｏｖｉｎｃｅ ， Ｃｈｉｎａ ｚｈａ ｏｌｉｎｇｙｕｎ８０１１２２＠ １６３．ｃｏｍ
摘要 目的： 验证贴壁方式分离人骨髓间充质干细胞， 并进行体外扩增培养的可行性。 方法： 实验于 ２００６－ ０２／１２ 在解放军济南军区总医院脊髓修复科完成。①实验材料： 骨髓来源于解放军济南军区总医院脊髓修 复科收治的脊髓完全性损伤患者， 对本实验知情同意。基础培养液由含体积分数为 ０．１５ 胎牛血清和低糖 α－ＭＥＭ 配置。②实验 方法： 无菌条件下髂后上棘穿刺抽取骨髓组织 ６ ｍＬ， 进行细胞培养， 观察细胞生长情况， 待细胞融合成片、长满培养瓶底部后， 用质量浓度为 ２．５ ｇ／Ｌ 的胰蛋白酶流过所有细胞表面。倒置显微镜下观察细胞变圆、部分脱壁后， 立即加入有血清培养液终止消 化。③实验评估： 取第 ３ 代生长状态良好的细胞， 胰蛋白酶消化制成细胞悬液， 接种， 以细胞数为纵坐标， 时间为横坐标， 绘制细 胞生长曲线。同时每隔 ２ ｈ 进行细胞贴壁率检测。 结果： ①骨髓间充质干细胞的形态学观察： 倒置显微镜下， 骨髓间充质干细胞接种 １ ｄ 即贴壁， 去除悬浮细胞后继续培养 ３ ｄ 贴 壁细胞开始增殖， 伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等。至 １４ ｄ 细胞密集在集落中心， 基本铺满瓶底， 第 ３～５ 代细胞呈 均匀一致的长梭型， 排列成旋涡状或放射状。②骨髓间充质干细胞的生长曲线： 细胞传代后 ３ ｄ 内处于潜伏期， ３ ｄ 后进入生长 期， ７ ｄ 后进入平台期。③骨髓间充质干细胞的贴壁率： 随着培养时间的延长， 骨髓间充质干细胞贴壁率逐渐升高。传代后 ２， ４， ６， ８， １０， １２， １４， １６， １８， ２０ ｈ 细胞贴壁率分别为 （ ２０．２０±０．２５） ％ ， （ ３３．００±０．２９） ％ ， （ ４６．５０±０．３２） ％ ， （ ６９．２０±０．３０） ％ ， （ ７６．６０± ０．３４） ％， （ ８６．５０±０．２７） ％， （ ９０．３０±０．２０） ％， （ ９６．１０±０．２８） ％， （ ９８．５０±０．１２） ％， （ ９９．００±０．０７） ％。 结论： 贴壁法分离骨髓间充质干细胞操作简便， 经体外扩增培养后细胞增殖活性强， 传代周期为 ７ ｄ， 是比较理想的骨髓间充质 干细胞培养方法。 关键词： 骨髓间充质干细胞； 贴壁； 分离培养； 细胞活性
中国组织工程研究与临床康复 第 １１ 卷 第 ２８ 期 ２００７－ ０７－ １５ 出版 Ｊ ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｖｅ Ｔｉｓ ｓ ｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓ ｅａｒｃｈ Ｊ ｕｌｙ １５， ２００７ Ｖｏｌ．１１， Ｎｏ．２８
临床医学
人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养
ＣＲＴＥＲ
赵凌云， 钱淑琴， 赵廷宝
Ａｄｈｅｒ ｅｎｔ ｓｅｐａｒ ａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒ ｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒ ｒ ｏｗ－ｄｅｒ ｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ
Ａｂｓｔｒ ａｃｔ ＡＩＭ： Ｔｏ ｉｎｖｅ ｓ ｔｉｇａ ｔｅ ｔｈｅ ｆｅ ａ ｓ ｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｓ ｅ ｇｒｅ ｇａ ｔｉｎｇ ａ ｎｄ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｂｏｎｅ ｍａ ｒｒｏｗ－ｄｅ ｒｉｖｅ ｄ ｍｅ ｓ ｅ ｎｃｈｙｍａ ｌ ｓ ｔｅ ｍ ｃｅ ｌｌｓ （ＭＳ Ｃｓ ） ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ａ ｄｈｅ ｒｅ ｎｃｅ ｍｅ ｔｈｏｄ． ＭＥＴＨＯＤＳ： Ｔｈｅ ｅ ｘｐｅ ｒｉｍｅ ｎｔ ｗａ ｓ ｃｏｎｄｕｃｔｅ ｄ ａ ｔ Ｄｅ ｐａ ｒｔｍｅ ｎｔ ｏｆ Ｓ ｐｉｎａ ｌ Ｃｏｒｄ Ｒｅ ｐａ ｉｒｉｎｇ， Ｇｅ ｎｅ ｒａ ｌ Ｈｏｓ ｐｉｔａ ｌ ｏｆ Ｊ ｉｎａ ｎ Ｍｉｌｉｔａ ｒｙ Ａｒｅ ａ Ｃｏｍｍａ ｎｄ ｏｆ Ｃｈｉｎｅ ｓ ｅ Ｐ ＬＡ ｆｒｏｍ Ｆｅ ｂｒｕａ ｒｙ ｔｏ Ｄｅ ｃｅ ｍｂｅ ｒ ２００６． ① Ｔｈｅ ｂｏｎｅ ｍａ ｒｒｏｗ ｗａ ｓ ｄｅ ｒｉｖｅ ｄ ｆｏｒｍ ｐａ ｔｉｅ ｎｔｓ ｓ ｕｆｆｅ ｒｅ ｄ ｆｒｏｍ ｆｒａ ｃｔｕｒｅ ｄｉｓ ｌｏｃａ ｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｓ ｐｉｎａ ｌ ｃｏｒｄ ｄａ ｍａ ｇｅ ｄ ｃｏｍｐｌｅ ｔｅ ｌｙ， ｗｈｏ ｗｅ ｒｅ ｔｒｅ ａ ｔｅ ｄ ａ ｔ Ｄｅ ｐａ ｒｔｍｅ ｎｔ ｏｆ Ｓ ｐｉｎａ ｌ Ｃｏｒｄ Ｒｅ ｐａ ｉｒｉｎｇ， Ｇｅ ｎｅ ｒａ ｌ Ｈｏｓ ｐｉｔａ ｌ ｏｆ Ｊ ｉｎａ ｎ Ｍｉｌｉｔａ ｒｙ Ａｒｅ ａ Ｃｏｍｍａ ｎｄ ｏｆ Ｃｈｉｎｅ ｓ ｅ Ｐ ＬＡ， ａ ｎｄ ｃｏｎｓ ｅ ｎｔｅ ｄ ｔｏ ｔｈｉｓ ｅ ｘｐｅ ｒｉｍｅ ｎｔ． Ｆｕｎｄａ ｍｅ ｎｔａ ｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓ ｏｌｕｔｉｏｎ ｃｏｍｐｒｉｓ ｅ ｄ ｆｅ ｔａ ｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓ ｅ ｒｕｍ ｗｉｔｈ ｖｏｌｕｍｅ ｆｒａ ｃｔｉｏｎ ｏｆ ０．１５ ａ ｎｄ ｌｏｗ ｃａ ｒｂｏｈｙｄｒａ ｔｅ ｓ α－ＭＥＭ． ②６ ｍＬ ｂｏｎｅ ｍａ ｒｒｏｗ ｗａ ｓ ｉｓ ｏｌａ ｔｅ ｄ ｓ ｔｅ ｒｉｌｅ ｌｙ ｆｒｏｍ ｐｏｓ ｔｅ ｒｉｏｒ ｓ ｕｐｅ ｒｉｏｒ ｉｌｉａ ｃ ｓ ｐｉｎｅ ｆｏｒ ｃｅ ｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ． Ｃｅ ｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｗａ ｓ ｏｂｓ ｅ ｒｖｅ ｄ ｕｎｔｉｌ ｃｅ ｌｌｓ ｃｏａ ｌｅ ｓ ｃｅ ｄ ａ ｎｄ ｃｏｖｅ ｒｅ ｄ ｔｈｅ ｂｏｔｔｏｍ ｏｆ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｌａ ｓ ｋ ｔｈｅ ｃｅ ｌｌｓ ｗｅ ｒｅ ｉｎｆｉｌｔｒａ ｔｅ ｄ ｂｙ ｔｒｙｐｓ ｉｎ ｗｉｔｈ ｃｏｎｃｅ ｎｔｒａ ｔｉｏｎ ｏｆ ２．５ ｇ／Ｌ． Ｆｕｎｄａ ｍｅ ｎｔａ ｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓ ｏｌｕｔｉｏｎ ｗａ ｓ ａ ｄｄｅ ｄ ｔｏ ｔｅ ｒｍｉｎａ ｔｅ ｃｏｎｃｏｃｔｉｏｎ ｗｈｅ ｎ ｃｅ ｌｌｓ ｔｕｒｎｅ ｄ ｉｎｔｏ ｃｉｒｃｌｅ ａ ｎｄ ｄｅ ｔａ ｃｈｅ ｄ ｐａ ｒｔｌｙ． ③Ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｇｅ ｎｅ ｒａ ｔｉｏｎ ｗｅ ｌｌ－ｇｒｅ ｗ ｃｅ ｌｌｓ ｗｅ ｒｅ ｄｉｇｅ ｓ ｔｅ ｄ ｉｎｔｏ ｃｅ ｌｌ ｓ ｕｓ ｐｅ ｎｓ ｉｏｎ ａ ｎｄ ｉｎｏｃｕｌａ ｔｅ ｄ． Ｃｅ ｌｌｓ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ ｗａ ｓ ｄｒａ ｗｎ ｔａ ｋｉｎｇ ａ ｍｏｕｎｔ ｏｆ ｃｅ ｌｌｓ ａ ｓ Ｙ－ａ ｘｉｓ ａ ｎｄ ｔｉｍｅ ａ ｓ Ｘ－ａ ｘｉｓ ． Ｓ ｉｍｕｌｔａ ｎｅ ｏｕｓ ｌｙ， ａ ｄｈｅ ｓ ｉｏｎ ｒａ ｔｅ ｗａ ｓ ｄｅ ｔｅ ｒｍｉｎｅ ｄ ｅ ｖｅ ｒｙ ２ ｈｏｕｒｓ ． ＲＥＳＵＬＴＳ： ①Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａ ｌ ｏｂｓ ｅ ｒｖａ ｔｉｏｎ ｏｆ ＭＳ Ｃｓ ： Ｕｎｄｅ ｒ ｉｎｖｅ ｒｔｅ ｄ ｍｉｃｒｏｓ ｃｏｐｅ ， ｔｈｅ ＭＳ Ｃｓ ｂｅ ｇａ ｎ ｔｏ ａ ｄｈｅ ｒｅ ｔｏ ｔｈｅ ｗａ ｌｌ ａ ｔ ｄａ ｙ １． ＭＳ Ｃｓ ｂｅ ｇａ ｎ ｔｏ ｐｒｏｌｉｆｅ ｒａ ｔｅ ａ ｎｄ ｂｅ ｃｏｍｅ ｉｎｔｏ ｅ ｌｌｉｐｓ ｅ ， Ｆｕｓ ｉｆｏｒｍ ｓ ｈａ ｐｅ ， ｐｏｌｙｇｏｎ ａ ｎｄ ｉｒｒｅ ｇｕｌａ ｒｉｔｙ ａ ｔ ｄａ ｙ ３． ＭＳ Ｃｓ ｃｏｎｃｅ ｎｔｒａ ｔｅ ｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅ ｎｔｅ ｒ ｏｆ ｃｏｌｏｎｙ ａ ｎｄ ｃｏｖｅ ｒｅ ｄ ｔｈｅ ｂｏｔｔｏｍ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｌａ ｓ ｋ ａ ｔ ｄａ ｙ １４． Ｔｈｅ ３ｒｄ－ ５ｔｈ ｇｅ ｎｅ ｒａ ｔｉｏｎ ＭＳ Ｃｓ ｐｒｅ ｓ ｅ ｎｔｅ ｄ ｌｏｎｇ－ｆｕｓ ｉｆｏｒｍ ｓ ｈａ ｐｅ ａ ｎｄ ａ ｒｒａ ｎｇｅ ｄ ｉｎｔｏ ｗｈｉｒｌｐｏｏｌ ｏｒ ｒａ ｄｉａ ｔｉｏｎ． ②Ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ＭＳ Ｃｓ ： ＭＳ Ｃｓ ｗｅ ｒｅ ｉｎ ｌａ ｔｅ ｎｃｙ ｉｎ ３ ｄａ ｙｓ ， ｃｏｎｖｅ ｒｔｅ ｄ ｉｎｔｏ ｇｒｏｗｉｎｇ ｐｅ ｒｉｏｄ ａ ｆｔｅ ｒ ３ ｄａ ｙｓ ａ ｎｄ ｅ ｎｔｅ ｒｅ ｄ ｉｎｔｏ ｓ ｔａ ｔｉｏｎａ ｒｙ ｐｈａ ｓ ｅ ｓ ａ ｆｔｅ ｒ ７ ｄａ ｙｓ ． ③Ａｄｈｅ ｒｅ ｎｃｅ ｒａ ｔｅ ｏｆ ＭＳ Ｃｓ ： Ｔｈｅ ａ ｄｈｅ ｒｅ ｎｃｅ ｒａ ｔｅ ｉｎｃｒｅ ａ ｓ ｅ ｄ ｇｒａ ｄｕａ ｌｌｙ ｗｉｔｈ ｔｉｍｅ ｇｏｅ ｓ ｂｙ． Ｔｈｅ ａ ｄｈｅ ｒｅ ｎｃｅ ｒａ ｔｅ ｓ ｗｅ ｒｅ （ ２０．２０±０．２５） ％ ， （ ３３．００± ０．２９） ％ ， （ ４６．５０ ±０．３２） ％ ， （ ６９．２０ ±０．３０） ％ ， （ ７６．６０ ±０．３４） ％ ， （ ８６．５０ ±０．２７） ％ ， （ ９０．３０ ±０．２０） ％ ， （ ９６．１０ ±０．２８） ％ ， （ ９８．５０ ± ０．１２） ％， （ ９９．００±０．０７） ％， ｒｅ ｓ ｐｅ ｃｔｉｖｅ ｌｙ ａ ｔ ２， ４， ６， ８， １０， １２， １４， １６， １８ ａ ｎｄ ２０ ｈｏｕｒｓ ａ ｆｔｅ ｒ ｐａ ｓ ｓ ａ ｇｅ ． ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ： Ｔｈｅ ａ ｄｈｅ ｒｅ ｎｃｅ ｓ ｅ ｐａ ｒａ ｔｉｏｎ ｍｅ ｔｈｏｄ ｃａ ｎ ｂｅ ｍａ ｎｉｐｕｌａ ｔｅ ｄ ｃｏｎｖｅ ｎｉｅ ｎｔｌｙ， ａ ｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅ ｒａ ｔｉｖｅ ａ ｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｅ ｌｌｓ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｓ ｓ ｔｒｏｎｇ ｗｉｔｈ ｐｅ ｒｉｏｄ ｏｆ ７ ｄａ ｙｓ ． Ｉｔ ｉｓ ａ ｎ ｉｄｅ ａ ｌ ｍｅ ｔｈｏｄ ｔｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ＭＳ Ｃｓ ．
Ｃｏｒｒｅ ｓ ｐｏｎｄｅ ｎｃｅ ｔｏ：
Ｚｈａ ｏ Ｔｉｎｇ－ｂａ ｏ，
Ｄｏｃｔｏｒ，
Ｃｈｉｅ ｆ
ｐｈｙｓ ｉｃｉａ ｎ， Ｄｅ ｐａ ｒｔｍｅ ｎｔ

ｏｆ Ｓ ｐｉｎａ ｌ Ｃｏｒｄ
Ｒｅ ｐａ ｉｒｉｎｇ， Ｇｅ ｎｅ ｒａ ｌ
Ｈｏｓ ｐｉｔａ ｌ ｏｆ Ｊ ｉｎａ ｎ
Ｍｉｌｉｔａ ｒｙ
Ａｒｅ ａ
Ｃｏｍｍａ ｎｄ ｏｆ Ｃｈｉｎｅ ｓ ｅ
Ｐ ＬＡ， Ｊ ｉｎａ ｎ ２５００３１，
Ｓ ｈａ ｎｄｏｎｇ Ｐ ｒｏｖｉｎｃｅ ，
Ｃｈｉｎａ
ｄｏｃｔｏｒｚｈａ ｏｔｉｎｇｂａ ｏ＠
１６３．ｃｏｍ
Ｒｅ ｃｅ ｉｖｅ ｄ： ２００７－０１－０４ Ａｃｃｅ ｐｔｅ ｄ： ２００７－０５－１５
Ｚｈａｏ ＬＹ， Ｑｉａｎ Ｓ Ｑ， Ｚｈａｏ ＴＢ．Ａｄｈｅｒｅｎｔ ｓ ｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓ ｅｎｃｈｙｍａｌ ｓ ｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ．Ｚｈｏｎｇｇｕｏ Ｚｕｚｈｉ Ｇｏｎｇｃｈｅｎｇ Ｙａｎｊｉｕ ｙｕ Ｌｉｎｃｈｕａｎｇ Ｋａｎｇｆｕ ２００７；１１（２８）：５６４９－５６５１（Ｃｈｉｎａ） ［ｗｗｗ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ／ｚｇｌｃｋｆ／ｅｊｏｕｒｎａｌ／ｕｐｆｉｌｅｓ ／０７－２８／２８ｋ－５６４９（ｐｓ ）．ｐｄｆ］
Ｄｅ ｐａ ｒｔｍｅ ｎｔ ｏｆ Ｓ ｐｉｎａ ｌ Ｃｏｒｄ Ｒｅ ｐａ ｉｒｉｎｇ， Ｇｅ ｎｅ ｒａ ｌ Ｈｏｓ ｐｉｔａ ｌ ｏｆ Ｊ ｉｎａ ｎ Ｍｉｌｉｔａ ｒｙ Ａｒｅ ａ Ｃｏｍｍａ ｎｄ ｏｆ Ｃｈｉｎｅ ｓ ｅ Ｐ ＬＡ， Ｊ ｉｎａ ｎ ２５００３１， Ｓ ｈａ ｎｄｏｎｇ Ｐ ｒｏｖｉｎｃｅ ， Ｃｈｉｎａ