骨髓间充质干细胞培养汇总.
实验项目一猪骨髓间充质干细胞的分离和培养
猪骨髓间充质干细胞的培养与分离实验准备：器材：手术刀片，手术刀柄，剪刀，镊子，弯钳，5ml灭菌注射器，7号注射针头，10ml离心管，离心机，100mm培养皿，75ml培养瓶试剂：低糖DMEM（含有10%FBS,75μg/ml青霉素，50μg/ml硫酸链霉素）1000iu/ml青链霉素的PBS（生理盐水）(装入灭菌的洗瓶中)无血清低糖DMEM.2%台盼蓝染液材料采集：一，胎猪骨髓采集：【1】 1，无菌条件下从猪子宫内取出胎儿置入到保温瓶中，加入含有青链霉素的PBS或生理盐水中，立即送回实验室。
2，在无菌操作下取下左右股骨，除净肌肉、骨膜及股骨两端软骨组织；用PBS冲洗3-4次用灭菌生理盐水冲洗干净，在超净工作台内剥离肌肉和骨膜，得到完整的股骨。
立即用含有1.0ml DMEM+3000iu/ml肝素的注射器冲骨髓腔，迅速换上5号的针头将冲出的骨髓血轻轻吹打，再加入等量培养液（DMEM+10%FBS）稀释，然后以1:4比例缓慢加入到Percoll分离液（1.073g/ml）的表面，1000r/min 30min,小心吸取乳白色的有核细胞层。
目前用于分离MSCs的方法主要有密度梯度离心法，流式细胞仪分离法和贴壁筛选法。
密度梯度离心法目前主要包括利用percoll分离液分离MSCs和利用淋巴细胞分离液分离MSCs两种。
Percoll密度梯度离心法根据细胞密度不同将细胞分为数层，因此得到的MSCs纯度较高，但是操作繁琐，而淋巴细胞密度梯度离心法虽得到的MSCs不及percoll密度梯度离心法得到的细胞纯度高，但是操作简单，且获得的MSCs增殖活性较强。
【13】来自:胎猪骨髓间充质干细胞核移植及核移植胚胎干细胞的分离取2-3月龄猪胎儿，在无菌操作下取下左右股骨，用含1000iu/ml青链霉素的PBS浸泡30min,除净肌肉、骨膜及股骨两端软骨组织；用PBS冲洗3-4遍；用吸有4ml а-MEM细胞培养液的一次性无菌5ml注射器刺入处理好的股骨的一端，冲出骨髓，然后用7号针头轻轻吹吸数次，使冲出的骨髓尽可能分散为单个细胞，100目滤沙过滤；1000rpm/min,离心5min,用а-MEM细胞培养液制成细胞悬液，计数后，调整有核细胞的密度为1-2x107/ml.,然后接种培养。
骨髓间充质干细胞总结
2003年8月，为给大家提供一个网上交流干细胞研究经验的平台，我们干细胞版设立了骨髓间充质干细胞培养讨论区，经过近三个月的讨论学习，我们既学习丰富了自己的知识体系，也对间充质干细胞尤其是分离培养方面有了更为翔实的认识，为了大家阅读的方便，我们决定把本版中的相关内容，同时参考部分书目和文献，做一总结。
一、骨髓间充质干细胞的分离目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。
密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。
随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。
1. 直接培养法（全骨髓培养法）1987年，Friedenstein等发现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，而且这些细胞扩增2 0-30代后仍能保持其多向分化潜能，这类细胞即为骨髓间充质干细胞（BMSC），其工作对今后MSC的研究具有重要意义，不仅证实了骨髓MSC的存在，而且创建了一种体外分离和培养MSC的简便可行的方法，得到了广泛的应用。
culture-spirit采用直接贴壁法，24-36小时首次换液，换液时用PBS洗两次，7 -10天传第一代，以后2-3天传代。
培养基采用Hyclone的DMEM/F-12（1:1），血清是天津TBD的FBS（顶级），得到了较好的培养结果。
布兰卡根据自己培养大鼠MSC的经验，详细介绍了实验步骤：（1）接种后60-80分钟，换液去除悬浮细胞（2）原代培养24h,48h各换液一次（3）观察细胞情况，在原代培养7天左右时，如观察到成片的典型形态的细胞，在瓶底用Marker笔标记，0.25%胰酶消化，镜下观察控制，约5-10分钟（室温太低时应放置到孵箱中），加入全培养基终止消化，瓶体朝上，吸管轻轻吹打4-8分钟，尤其是标记部位。
小鼠骨髓间充质干细胞培养
小鼠骨髓间充质干细胞培养目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。
密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。
随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。
实验准备：1实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g。
2实验材料与试剂高糖DMEM培养基，胎牛血清，双抗（青霉素钠，链霉素），培养皿，镊子，眼科剪，止血钳，1mL注射器操作步骤1、小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取预冷的培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，冲洗液直接收集在插在冰上的离心管中，1500rpm离心5分钟，弃上清，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液重悬细胞，接种于培养皿中（一只小鼠种一个60mm的培养皿），置于5�2，37℃，培养过夜，吸出上清，用PBS洗两遍，洗掉未贴壁的细胞，加入新鲜的培养液，继续培养。
以后每两天换液1次，并观察细胞形态。
待细胞长至80%-85%时传代（1传2）2、原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。
传代后细胞生长迅速。
采用贴壁培养法可获得足够数量、生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。
骨髓间充质干细胞MSCs培养方案
骨髓间充质干细胞培养方法大鼠骨髓间充质干细胞培养方法仪器和材料磁力搅拌器电子天平水浴振荡器pH计真空泵离心机血球计数板1 x 100ml量筒1 x 1L 容量瓶1 x 500ml玻璃烧杯2 x 500ml 带盖无菌玻璃瓶1 x 100ml 带盖无菌玻璃瓶1 x 0.22um 无菌滤膜2 x 100mm 无菌培养皿4 x T25 无菌培养瓶4 x 15ml 无菌离心管2 x 转子2 x 5ml 无菌移液管1ml 无菌枪头封口膜脱脂棉3 x 手术剪2 x 直头镊子1 x 骨钳2 x 手术刀（刀柄+刀片）1 x 100ml 塑料烧杯（盛废液）2 x 100ml 玻璃烧杯低糖DMEM培养基粉末胎牛血清PBS双抗75%酒精SOLUTION PREPARATION溶液制备所有的水溶液均用二蒸水配制。
∙先将试剂在烧杯中用少量二蒸水溶解，然后补加至最终体积。
∙用容量瓶配制溶液。
原代培养：密度梯度离心法1)取鼠龄3-4w，体重70-120g的SD大鼠3-4只（雌雄不限）；2)将SD大鼠颈椎脱臼处死，浸入盛有约300-500ml 75%酒精的1000ml烧杯中浸泡5min；3)用镊子取出后用脱脂棉擦掉多余酒精，置于培养皿内，用手术剪剪开大腿内侧皮肤和肌肉，分离出股骨和胫骨，沿肌肉白线处清除其周围的肌肉，在培养皿中用5-10ml 75%酒精浸泡5min后移入超净工作台中；4)用镊子夹住大鼠股骨和胫骨放置于无菌的培养皿上方，依次用3-5ml PBS和无血清培养基冲洗2~3次后，移入另一无菌培养皿中。
用镊子和骨钳固定股骨，分别用10mL 注射器在骨两端钻孔；5)用5ml（或1ml）注射器吸取培养基从骨一端孔处插入，从上至下缓慢冲洗骨髓腔，用下方的无菌培养皿收集骨髓悬液，重复此过程2~3次；6)在15ml离心管中加入5mL Ficoll分离液，再将骨髓悬液沿管壁缓缓加入其上，注意一定要轻缓，不能让骨髓悬液与分离液相混合，调整骨髓悬液与分离液的体积比为2：1；7)将离心管以2000rpm离心20min，离心后管内物质分为三层，用吸管小心吸取中间的白膜层置于一个新的离心管内；8)在此离心管中加5ml培养基，吹打成单细胞悬液，1000rpm离心5min，离心后用吸管吸去上清液并去掉，加入完全培养基，并轻轻吹散细胞10~20次，制成细胞悬液；9)以5×106cell/ml的细胞密度接种于T25培养瓶中（培养瓶中培养基终体积为5ml）, 置于CO2培养箱中培养，48h后用吸管吸出全部培养液并去掉，添加新鲜培养液，以后每隔三天全量换液一次。
人骨髓间充质干细胞的培养与鉴定
人骨髓间充质干细胞的培养与鉴定目的分离培养人骨髓间充质干细胞（human bone marrow-derived mesenchymal stem cells，hBMSCs），体外观察其生长特性。
方法采用密度梯度离心结合贴壁培养法自脐血中分离间充质干细胞，倒置显微镜下观察其形态及生长情况；流式细胞仪分析细胞周期并检测细胞表面标志物。
结果纯化的hBMSCs 贴壁生长，呈均一梭形，具有较强的增殖能力，流式细胞仪分析P3代hBMSCs 稳定表达间充质干细胞表面抗原标志CD73，CD90和CD105等。
结论本实验分离培养的hBMSCs具有较强的增殖能力，表达间充质干细胞的表面标记。
Abstract：Objective To isolate and culture human bone marrow derived mesenchymal stem cells（hBMSCs），and to observe biological characteristics of hBMSCs. Methods Bone marrow mononuclear cells were separated by the method of density gradient centrifugation and MSCs were obtained by adhere culture.The cell morphology and their growth characteristics in vitro were observed under an inverted phase contrast microscope and the cell cycles were tested by flowing cytometry. Mesenchymal like stem cells were identified by surface marker with flow cytometry.Results hBMSCs were adhered like a fibroblast morphology and with pool like growth alinement.Flow cytometry showed that the third passage cells were positive for CD73，CD90and CD105 expression.Conclusion The MSCs from bone marrow in this study show great capability of proliferation.Key words：Bone marrow mesenchymal stem cells；Separation；Culture and identification间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是来源于中胚层的具有多向分化潜能的干细胞。
骨髓间充质干细胞培养方法大全
一、四种方法简介及优缺点：骨髓间充质干细胞主要有4种体外分离方法：贴壁筛选法，密度梯度离心法，流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法。
贴壁筛选法是利用细胞贴壁时间及贴壁牢固性的不同逐步将非贴壁细胞和其它杂质细胞去除的一种简单易行的培养MSCS的方法。
贴壁分离培养法分离的MSCS能在体外培养条件下生长良好、可连续传代，体外培养扩增能力较强，其缺点是细胞纯度较低。
此方法简便，冲出骨髓直接培养，然后利用骨髓MSCS 贴壁生长特性，更换培养液逐步去处漂浮生长的造血系细胞即可获得较纯化的MSCS；而且骨髓中的造血干细胞能分泌生长因子和促贴壁物质，可促进MSCS 贴壁生长，因此全骨髓贴壁法更为可取。
密度梯度离心法梯度离心法的核心主要是基于密度梯度离心技术。
梯度离心法是根据骨髓中细胞成分的比重不同，使用淋巴细胞分离液提取单个核细胞，再进行贴壁培养，从而达到分离、纯化MSCS的目的。
Pittenger等的研究发现通过密度梯度离心分离培养的间充质干细胞在第一代时纯度可以达到95%。
常用的分离方法免疫磁珠法，是利用免疫学的技术分离MSCS，分离细胞的纯度高。
Phinney 用一种免疫耗损技术精确地将造血细胞系和内皮细胞系从基质细胞中分离出来，提供了一种能高效的分离纯化间充质干细胞的方法，但目前仍未筛选到真正特异性的细胞表面标记;而且，这两种分离方法的操作对细胞活性都有较大影响，造成MSCS损伤，出现增殖缓慢等问题，这些技术问题很大程度上限制了这两种方法的应用。
因此，如何能简便高效地获得均质性的间充质干细胞和细胞群仍需要继续探索。
分离细疫磁珠分离和流式细胞仪筛选的方法，不仅对细胞活性影响较大，而且操作复杂，价格昂贵。
然而，这些纯化间充质干细胞的方法比较复杂，一般仅限于在各自的实验室应用。
二、具体实验流程1. 免疫磁珠法分离纯化骨髓间充质干细胞：1 实验动物Sd大鼠2 试剂和仪器BSA、荧光标记小鼠抗体x、PE磁珠试剂盒、抗生物素磁珠、MiniMACS分离器及MS分离柱。
骨髓间充质干细胞-MSC-原代培养与传代培养
骨髓间充质干细胞(MSC)原代培养与传代培养准备工作（1）试管、试管架、滴管、吸管、小鼠固定架、玻璃瓶、玻璃皿、烧杯、橡皮头、剪刀、镊子、纱布、棉球、酒精灯、滴管、移液器、细胞计数器、生理盐水、PBS、双抗（青链霉素）、75%酒精、95%酒精、培养瓶（50ml，260ml）。
（2）BALB/C小鼠（4~5周龄，18~22g，雌雄不限）、胎牛血清（灭活）、DMEM-LG 培养液（美国GIBCO）（3）针头与注射器：4.5号、7号针头（冲小鼠股骨、胫骨和肱骨骨髓，制单细胞悬液）。
实验前准备（1）实验室消毒，隔离衣消毒，小鼠固定架消毒。
配10%FBS培养液，加双抗（内含青霉素、链霉素各100μg/ml）。
（2）用75% 酒精擦拭无菌操作台面，取各种已消毒的培养用品置于超净台面，无菌室及超净台用紫外灯照射30~60 分钟灭菌。
（3）开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
穿隔离衣，戴手套。
用70% 酒精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风机运转10 分钟后，才可开始实验操作。
点燃酒精灯，安装吸管帽。
实验步骤（1）BALB/C纯系小鼠脱臼处死后，75%乙醇浸泡5min后，在无菌操作台上无菌条件下分离双侧股骨及胫骨，在含生理盐水的50mm2玻璃平皿中去除股骨周围肌肉组织，剪去包括骺板在内的两侧骺端，用10ml注射器（配4.5号针头）抽取适量含10%FBS的完全培养基冲洗骨髓腔，将骨髓冲入培养瓶。
依次用7号针头和4.5号针头（或依次过21、23、25号）反复吹打骨髓细胞悬液，制成单细胞悬液。
细胞悬液在1000rpm离心5min后收集细胞或进行密度梯度离心。
（2）将单细胞悬液于1:2比例加到含1.082比重Percoll细胞分离液的离心管中，4℃条件下，经500g密度梯度离心25min，小心收集离心液界面上乳白色云雾状的单核细胞层，加入等量无血清培养基或磷酸盐缓冲液（PBS）充分洗涤（500g离心5min或180g离心10min）2次，去上清，用10%FBS的培养基悬浮细胞（用0.83%氯化胺破碎红细胞，培养液重悬细胞）。
大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定
大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定干细胞研究一直是生物医学领域的前沿热点，其中骨髓间充质干细胞（BMSCs）因其具有多向分化潜能和低免疫原性而备受。
在众多研究中，大鼠BMSCs的体外培养和鉴定方法为其在科研和临床领域的应用提供了基础。
本文将就大鼠BMSCs的培养、鉴定方法进行详细介绍，并结合实验数据进行阐述。
BMSCs是一种成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，可以分化为多种细胞类型，如成骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等。
因其来源广泛，免疫原性低，大鼠BMSCs已成为再生医学、免疫调节等领域的重要研究对象。
近年来，随着生物技术的不断发展，BMSCs的培养和鉴定方法也得到了不断优化和改进。
BMSCs的培养需要无菌环境，常用的培养基为DMEM、F12等，添加适量的生长因子和抗生素以维持细胞的生长和存活。
细胞的鉴定主要包括形态学观察、表面标志物检测和多向分化潜能的证实。
其中，表面标志物如CDCD90等可用来区分BMSCs和其他细胞，多向分化潜能的证实包括成骨、成脂和成肌等方向的诱导分化。
本实验采用大鼠BMSCs的常规体外培养方法。
具体步骤如下：采集大鼠骨髓：在无菌环境下，用注射器抽取大鼠股骨和胫骨骨髓，加入肝素抗凝。
细胞分离：将采集的骨髓用密度梯度离心法分离出单个核细胞。
细胞培养：将单个核细胞接种于培养瓶中，用含10%血清、1%抗生素和1%谷氨酰胺的培养基培养。
细胞鉴定：经过约7-10天的培养，细胞达到80%-90%融合时，进行细胞鉴定。
通过形态学观察、表面标志物检测和多向分化潜能的证实，对BMSCs进行鉴定。
通过观察细胞的形态和生长情况，发现培养的BMSCs呈典型的长梭形，且细胞间连接紧密（图1）。
经表面标志物检测，BMSCs表达CD29和CD90等间充质干细胞表面标志物（图2）。
在多向分化潜能的证实中，我们发现BMSCs经成骨、成脂和成肌诱导后，可分别形成矿化结节、脂肪滴和肌纤维（图3）。
这些结果说明所培养的细胞为BMSCs。
骨髓间充质干细胞分离培养鉴定方法
骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离培养鉴定方法主要包括以下步骤：**一、分离方法**1. **差速贴壁法**：利用BMSCs与骨髓中其他细胞的贴壁性能差异及酶消化敏感性差异进行分离。
这种方法快速、简单、经济，但细胞纯度可能相对较低。
2. **密度梯度离心法**：基于骨髓中不同细胞的大小和密度差异进行分选。
通过流式细胞术检测，细胞表面抗原表达CD105，CD73和CD90必须≥95%，同时表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α，或CD19和HLA － DＲ必须≤2%。
**二、培养方法**培养BMSCs的难点在于保持细胞活性。
不同种属来源的BMSCs在体外培养扩增方法基本相似，但细微的营养条件、培养环境等差异都将会对细胞性能产生影响。
**三、鉴定方法**1. **细胞形态学观察**：利用组织块贴壁法、酶消化法或其结合来分离MSC，并通过传代培养进行形态学观察。
几乎所有的MSC都是贴壁生长，具有较强的贴壁能力。
MSC多数呈纤维细胞样生长，少量呈梭形或不规则三角形。
2. **表面标志物鉴定**：采用流式细胞仪对MSC的细胞表型进行鉴定。
MSC的表面抗原具有非专一性，可以同时表达间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志，如粘附因子、生长因子和细胞因子受体以及整合素家族等。
MSC的细胞表面标志物鉴定标准为：CD105、CD73和CD90的阳性率≥90%；而CD45、CD34、CD14、CD19和HLA-DR 呈阴性，阳性率≤5%。
综上所述，骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定是一个复杂的过程，涉及多个步骤和专业的技术操作。
在进行这些操作时，需要严格遵守实验规程，确保实验的准确性和安全性。
同时，对实验结果的解读也需要具备一定的专业知识和技能。
实验方案：胎猪的骨髓间充质干细胞培养及鉴定
猪骨髓间充质干细胞的培养与分离实验材料：材料：骨髓（肋骨，胫腓骨，股骨，髂骨,肱骨）器材：手术刀片，手术刀柄，剪刀，镊子，弯骨钳，注射器（5ml,20ml）针头（5,7,11,16,19,21G）100目滤沙。
100mmx20mm培养皿（用于盛放冲洗的骨髓液）60mmx15mm培养皿，24孔板(原代培养)，35mmx10mm培养皿75cm2培养瓶，25cm2培养瓶，6孔板（接种培养）50ml 离心管,15ml离心管毛细吸管(吸取分离层的细胞)5ml移液管，5ml移液枪用于15ml离心管和50ml离心管使用的离心机转子，计数板，计数器，盖玻片(放于无水酒精中浸泡)，吸水纸，洗瓶。
冻存管（red cap,2.0ml）记号笔，废液缸，封口胶带，剪刀。
试剂：肝素，L-DMEM,15%（10%）胎牛血清的DMEM,а-MEM细胞培养液青霉素100iu/ml,链霉素100iu/ml70%Percoll分离液（或者是1.073g/ml的密度）（1.037g/ml）（1.077g/ml）；Ficoll分离液（1.071±0.001g/ml）(1.077g/ml)，0.25%胰蛋白酶（0.2%胰蛋白酶+0.02%EDTA;0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA）,TNE（0.25%胰酶+0.01%EDTA）骨髓冲洗液（含有1ml的3000iu/ml的DMEM）,灭菌PBS,冻存液（70%а-MEM+10%DMSO+20%NBS）（DMEM+10%FBS+10%DMSO）实验步骤：方法一：分层离心细胞全培养法原代培养1除杂取2-3月龄猪胎儿，无菌操作下取下左右股骨，立即用含1000iu/ml青链霉素的PBS浸泡30min;除净肌肉、骨膜及股骨两端软骨组织,然后放入到35mm x10mm培养皿中。
2取骨髓细胞用PBS冲洗3-4次后，用一次性无菌注射器吸取4ml 1000u/ml肝素的无血清α-MEM细胞培养液（或者4-5ml 3000iu/ml肝素的无血清L-DMEM）刺入处理好的骨一端，冲出骨髓直至发白。
骨髓间充质干细胞的体外培养
Ａ ｌ ｔ ｏ ｉｌｆＬｚｏ ｅｉ ｌ ｏｏ ｅ Ｌｚｏ ． ｉ ｕｎ６ ６０ ， ｈｎ ｆ ｉｅ Ｈ ｓ ｔ ｕ ｕＭ ｄ ａ Ｃｌｇ ，ａｈｕ Ｓ ｈａ ０ ０ Ｃ ｉ ｉ ｆ ａｄ ｐａ ｏ ｈ ｃ ｌ ｃ ４ ａ 【 ｂｔ ｃ】 Ｏ ｊｃｖ Ｔ ｓｂｉ ｆ ｓ ｌ ｍ ｔ ｄｗ ｉ ｐｒ ｅａｄｐｒｙｂｎ ａ ｏ ｅ ｎｈｍｌｓ ｍ ｃｌ （ Ｓ ｓ Ａ ｓ ａｔ ｒ ｂｅｔ ｅ ｏｅ ａｌｈａ ｅ ｉｅ ｅ ｏ ｈ ｈｓ ａａ ｎ ｕｉ ｏｅｍ ｒ ｗｍ ｓ ｅｙ ａ ｔ ｅｓＭ Ｃ ） ｉ ｔ ｓ ａｂ ｈ ｃ ｅ ｔ ｆ ｒ ｅ ｅ
・
ｌ Ｏ２ ・ ６
川 学 ２０ ０８年 ｌ 第 ２ （ １ ） Ｓ ｈａ ｅｉ ｌ ｏｒ ｌ２０ ，ｏ．９ Ｎ ．２ ２月 ９卷 第 ２期 ｉ ｌＭ ｄｃ ｕｎ ，０８ Ｖ１２ ． ｏ １ ｃ ｔｌ ａＪ ａ
论 著
红 ， 昌平 ， 晓琳 杜 李 钟
（ 州 医 学 院 附 属 医 院 消 化 内科 ， 川 泸 州 ６６０ ） 泸 四 ４００
【 摘要 】 目的 建立骨髓 问充质干 细胞（ Ｃ） ＭＳ ｓ体外分 离纯化 的方法 ， 索 Ｍ Ｃ 体外培 养的最佳方法 ， 探 Ｓｓ 为细胞工程 学提供 细胞来源。方 法 ①Ｍ Ｃ 的分 离、 Ｓｓ 培养 ： 在无茵条件下取 ３— ４周龄 Ｗｉａ 雄性大鼠四肢骨的骨髓细胞 ， ｓｒ ｔ 采用裂解
及 荧光 染料 后 见 Ｃ ４ 、 Ｄ ０染 色呈 阳 性 ，Ｄ ５染 色呈 阴性 反 应 。 结 论 采 用 裂 解 红 细 胞 与 贴 壁 培 养 法相 结 合 分 离 、 Ｄ４ Ｃ ｇ Ｃ４ 纯
化 Ｍ Ｃ， Ｓ ｓ 可得 到 活 性 和 纯 度 均较 好 的 Ｍ Ｃ 。 Ｓ ｓ
骨髓间充质干细胞培养
废液缸 PBS 或 N.S.冲洗 N.S.冲洗 5ml PBS 5%trypsin+EDTA 0.125~0.25ml 血清200 血清200 ul 混合液
25 cm2
显微镜观察3~5 显微镜观察3~5 min 废液缸 PBS 或 N.S.
废液缸Biblioteka 工作液离心机 1200rpm× 1200rpm×10min
离心机 1200rpm× 1200rpm×10min 6ml (25 cm2) 12~18ml (75 cm2)
废液缸
废液缸
工作液
离心机 1200rpm× 1200rpm×10min 培养瓶
去除悬浮液
废液缸
PBS 或 N.S.冲洗 N.S.冲洗
工作液
换液
废液缸(半量) 废液缸(半量)
工作液
消化传代
人骨髓源间充质干细胞 分离培养技术
24~48h
取骨髓
72h
分离单个核细胞
80%
去除悬浮液 存
换
液
消化传代
冻
分离单个核细胞
淋巴细胞分层液 骨髓样本(缓慢) 骨髓样本(缓慢) (经ＰＢＳ稀释３～４倍) 经ＰＢＳ稀释３～４倍) 单个核细胞 PBS
离心机 离心管 1400rpm× 1400rpm×30min (慢) (慢 PBS 或 N.S. 或 D-HANKS
废液缸
离心机 1200rpm× 1200rpm×10min
离心机 1200rpm× 1200rpm×10min
离心机 1200rpm× 1200rpm×10min
废液缸
1ml 冻存液
冻存管
注意：
• 多份样本应提前标注； • 放入CO2孵箱前应松瓶口，并注意孵箱内水 放入CO
成人骨髓间充质干细胞完全培养基原理
成人骨髓间充质干细胞完全培养基原理间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，简称MSCs）是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，存在于多种组织器官中。
成人骨髓是MSCs的重要来源之一，因其易于获取且细胞数量相对丰富而备受关注。
为了有效地维持和扩增骨髓间充质干细胞，开发一种适宜的完全培养基至关重要。
本文将详细阐述成人骨髓间充质干细胞完全培养基的原理。
一、培养基的组成成人骨髓间充质干细胞完全培养基由基础培养基、添加剂和血清组成。
基础培养基提供了细胞生长所需的基本营养物质，如葡萄糖、氨基酸、维生素和无机盐等。
添加剂则包括生长因子、细胞因子和其他生物活性物质，以促进细胞的增殖和分化。
血清作为培养基的补充成分，提供了丰富的生长因子、激素和其他生物活性物质，有助于维持细胞的生理状态。
二、生长因子的作用在成人骨髓间充质干细胞完全培养基中，生长因子起着至关重要的作用。
它们通过与细胞表面的特异性受体结合，激活细胞内信号通路，进而调控细胞的增殖、分化和凋亡。
例如，血小板源性生长因子（PDGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）和表皮生长因子（EGF）等可以促进MSCs的增殖。
同时，转化生长因子β（TGF-β）、骨形态发生蛋白（BMP）等可以诱导MSCs向骨、软骨和脂肪等组织分化。
三、细胞因子的调控细胞因子是一类具有生物活性的小分子蛋白质，它们在细胞间通信和免疫调节中发挥重要作用。
在成人骨髓间充质干细胞完全培养基中，细胞因子如白细胞介素（IL）、干扰素（IFN）和肿瘤坏死因子（TNF）等可以调节MSCs的免疫功能和炎症反应。
此外，细胞因子还可以与其他生长因子协同作用，共同调控MSCs的生长和分化。
四、培养条件的优化为了获得高效的骨髓间充质干细胞扩增，还需要对培养条件进行优化。
这包括控制培养温度、湿度、气体浓度和机械刺激等参数，以模拟体内环境并促进细胞生长。
同时，避免污染和减少细胞应激也是培养过程中的关键因素。
骨髓间充质细胞共培养
骨髓间充质细胞共培养
骨髓间充质细胞（BMSCs）是一种多能干细胞，具有广泛的分化潜能和免疫调节作用。
BMSCs可以通过共培养的方式与其他细胞相互作用，从而影响它们的生长、分化和功能。
共培养是指将两种或更多种不同类型的细胞放在同一培养皿中，让它们相互作用。
BMSCs与其他细胞的共培养可以通过直接接触或间接接触的方式进行。
直接接触是指BMSCs与其他细胞直接接触，而间接接触是指BMSCs释放的细胞因子通过介质传递到其他细胞中。
BMSCs与其他细胞的共培养可以产生多种效应。
首先，BMSCs可以促进其他细胞的增殖和分化。
例如，BMSCs与神经元的共培养可以促进神经元的生长和分化，从而有助于神经再生和修复。
其次，BMSCs可以调节其他细胞的免疫反应。
BMSCs可以通过释放细胞因子来抑制其他细胞的免疫反应，从而减轻炎症和自身免疫性疾病等疾病的症状。
此外，BMSCs还可以促进其他细胞的代谢和功能。
例如，BMSCs与心肌细胞的共培养可以促进心肌细胞的代谢和收缩功能，从而有助于心脏功能的恢复。
BMSCs与其他细胞的共培养是一种重要的细胞学研究方法，可以用于研究细胞间相互作用的机制，以及开发新的细胞治疗方法。
未来，我们可以进一步探索BMSCs与其他细胞的共培养的机制和效应，以期为临床治疗提供更有效的细胞治疗策略。
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骨髓间充质干细胞表面标记物鉴定
取融合至90%左右生长状态良好第3代骨髓 间充质干细胞，胰蛋白酶消化、室温离心、细胞 计数，调整待测样本细胞数为1×109 L-1，分 装至各PE管中，依次加入单克隆抗体CD44、 CD29、CD90、CD45、CD34、CD11b，每 管设立同型阴性对照组(对照组中不加任何抗体)。 常温避光孵育40 min，PBS冲洗细胞，细胞重 悬，经流式细胞仪检测分析。
结果
刚接种于培养瓶的骨髓细胞大多数悬浮于培养液中，细胞呈圆形，大小不一。接种 24 h后开始贴壁，通过更换培养液，去除悬浮未贴壁细胞，48 h后贴壁细胞逐渐伸展为 梭形、多角形、不规则圆形，排列不规则(图1A)。7 d后，贴壁细胞显著增多，以小圆形 和梭形细胞为多，部分细胞排列趋于平行，部分成旋涡状生长(图1B)。第3代骨髓间充质 干细胞生长较原代细胞快，以梭形细胞为主(图1C)。细胞传代至第8代，细胞增殖活力未 见明显变化，主要以大而铺展的多形细胞为主(图1D)。
流式细胞仪检测第3代骨髓间充质干细胞表dm 标记物的表达，结果显示：细胞均一 表达CD44、CD29、CD90，阳性率分别为99.69%、83.99%、95.05%，而 CD45、CD34、CD11b/c则呈阴性表达，分别为0.28%，0.62%，4.25%(图 2)。
经成骨诱导剂培养11 d后，细胞胞质内充满颗粒，细胞呈集落样生长， 细胞间可见钙质沉积，细胞结节中心的细胞融合失去细胞结构，钙结节形成 明显，经茜素红染色呈红色结节(图3B)；经碱性磷酸酶染色可见细胞外基 质有大量紫褐色沉淀，呈强阳性表达(图3C)；经vonkossa矿化染色可见 细胞聚集处有黑色固块，岛状分布，呈强阳性表达(图3D)。骨髓间充质干 细胞经成软骨细胞诱导剂培养21 d后，诱导而成的软骨细胞变大、变圆，表 面变的光滑，经甲苯胺蓝染色，可见胞质呈蓝色(图3E)。骨髓间充质干细胞 经成脂诱导剂培养19 d后，诱导而成的脂肪细胞脂质累积，脂滴数量增加并 相互融合，细胞由长梭形变为圆形、多边形，经油红O染色显示许多细胞的 胞浆内有大量脂质沉淀(图3F)。
全骨髓贴壁接触培养SD大鼠骨 髓间充质干细胞
省科学技术计划项目
主要内容
1.前言 2. 实验方法 3. 结果 4. 结论
前言
近来研究表明，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)不但具有来源广泛、易于获取、增殖迅速、可自体 移植、体外基因转染率高等特点，而且在不同诱导剂培养下可分别诱导分 化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞，神经细胞及肝细胞等已成为适合 组织和细胞移植的种子细胞，以及基因治疗的理想靶细胞。但在骨髓中骨 髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓有核细胞总数的0.001%-0.1%，如 何为组织和细胞移植及基因治疗提供数量充足、活性良好的骨髓间充质干 细胞成为国内外学者研究的重点。 依据骨髓间充质干细胞对塑料培养瓶具有黏附贴壁特性，实验采用贴 壁法，建立一套简单、快速、有效的SD大鼠骨髓间充质干细胞分离培养 、增殖和纯化方法，观察其生长形态和生物学特性，验证其向成骨、成软 骨、成脂分化能力，为进一步研究骨髓间充质干细胞移植、基因治疗及组 织工程奠定实验基础。
实验方法
1、骨髓间充质干细胞的原代分离及传代培养 2、骨髓间充质干细胞的形态学观察 3、骨髓间充质干细胞生长曲线的绘制 4、骨髓间充质干细胞表面标记物鉴定 5、骨髓间充质干细胞多向诱导分化
骨髓间充质干细胞的原代分离及传代培养
10%水合氯醛麻醉大鼠，经颈椎脱臼处死，大鼠全身浸 泡于体积分数为75%乙醇消毒30 min，于超净台无菌 操作下取其双侧股骨与胫骨，PBS冲洗，剪去骨两端干 骺端，用10 mL注射器吸取LG-DMEM培养液反复冲洗 骨髓腔，收集经细胞筛过滤后的细胞悬液，以1 000 r/min离心5 min。弃上清，以 1×109 L-1的细胞浓 度接种于25 cm2塑料培养瓶，置于37℃、体积分数为 5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。24 h后全量换液， 2，5 d分别半量换液，7 d全量换液。待培养瓶中细胞 分裂增殖80%-90%汇合单层时用1.5 mL TrypsinEDTA解离细胞，当细胞充分离散时，加入5 mL的含血 清培养基终止消化，离心细胞悬液，1 000 r/min离心 5 min。弃上清，加入含体积分数为10%胎牛血清的 LG-DMEM培养基，将重悬的细胞悬液以1∶2比例进行 传代。
结论
上述实验结果证实，体外分离培养的SD大鼠 骨髓细胞为纯度较高的骨髓间充质干细胞而非其 他造血谱系干细胞，并建立了一套简单、有效、 获得纯度较高的骨髓间充质干细胞分离培养、增 殖、鉴定的方法。传代至第3代时，可获得纯度 高、数量足、生物活性高的骨髓间充质干细胞， 为本研究课题进一步实验研究奠定了实践基础以 及提供了数量充足的种子细胞。
骨髓间充质干细胞多向诱导分化
取生长良好的第3代骨髓间充质干细胞，以 5×107 L-1接种于24孔板，待细胞贴壁生长融 合至70%-80%时，向各诱导孔中分别加入成 骨细胞诱导剂(含地塞米松、β-甘油磷酸钠、维 生素C-2磷酸钠)，成软骨细胞诱导剂(含地塞米 松、转化生长因子β、维生素C)，成脂细胞诱导 剂(含地塞米松、胰岛素、吲哚美辛)。各诱导孔 定期换液，以未经处理的骨髓间
取原代和第8代细胞，每日用倒置相差显微镜 观察其生长形态及特征并照相记录。取生长良好 的细胞于含10%二甲基亚砜的血清中冻存，2周 后复苏，锥虫蓝拒染实验检测死亡及存活细胞， 继续于37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱中培 养。
骨髓间充质干细胞生长曲线的绘制
取第1，3代细胞，胰酶消化后计数，以 5×104个/孔接种于96孔板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃，饱和湿度，体积分数为 5%CO2培养箱孵育2 h后，用酶联免疫检测仪 于450 nm波长下检测吸光度值。然后在检测第 1，2，3，4，5，6，7天同一时间作相同检测。 根据吸光度值绘制细胞增殖曲线。