骨髓间充质干细胞培养

骨髓间充质干细胞的原代分离及传代培养
❖ 10%水合氯醛麻醉大鼠，经颈椎脱臼处死，大鼠全身浸泡于 体积分数为75%乙醇消毒30 min，于超净台无菌操作下取其 双侧股骨与胫骨，PBS冲洗，剪去骨两端干骺端，用10 mL 注射器吸取LG-DMEM培养液反复冲洗骨髓腔，收集经细胞 筛过滤后的细胞悬液，以1 000 r/min离心5 min。弃上清， 以 1×109 L-1的细胞浓度接种于25 cm2塑料培养瓶，置于 37℃、体积分数为5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。24 h 后全量换液，2，5 d分别半量换液，7 d全量换液。待培养 瓶中细胞分裂增殖80%-90%汇合单层时用1.5 mL TrypsinEDTA解离细胞，当细胞充分离散时，加入5 mL的含血清培 养基终止消化，离心细胞悬液，1 000 r/min离心5 min。弃 上清，加入含体积分数为10%胎牛血清的LG-DMEM培养基 ，将重悬的细胞悬液以1∶2比例进行传代。
。 而铺展的多形细胞为主(图1D)
❖ 流式细胞仪检测第3代骨髓间充质干细胞表dm 标记物的表达，结果显示：细胞均一表达 CD44、CD29、CD90，阳性率分别为99.69%、83.99%、95.05%，而CD45、CD34、 CD11b/c则呈阴性表达，分别为0.28%，0.62%，4.25%(图2)。
全骨髓贴壁接触培养SD大鼠骨 髓间充质干细胞
省科学技术计划项目
主要内容
1.前言 2. 实验方法 3. 结果 4. 结论
前言
❖
近来研究表明，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem
cells，BMSCs)不但具有来源广泛、易于获取、增殖迅速、可自体移植、
体外基因转染率高等特点，而且在不同诱导剂培养下可分别诱导分化为成
结论
❖ 上述实验结果证实，体外分离培养的SD大 鼠骨髓细胞为纯度较高的骨髓间充质干细胞 而非其他造血谱系干细胞，并建立了一套简 单、有效、获得纯度较高的骨髓间充质干细 胞分离培养、增殖、鉴定的方法。传代至第3 代时，可获得纯度高、数量足、生物活性高 的骨髓间充质干细胞，为本研究课题进一步 实验研究奠定了实践基础以及提供了数量充 足的种子细胞。
骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞，神经细胞及肝细胞等已成为适合组织和
细胞移植的种子细胞，以及基因治疗的理想靶细胞。但在骨髓中骨髓间充
质干细胞含量极低，仅占骨髓有核细胞总数的0.001%-0.1%，如何为组织
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和细胞移植及基因治疗提供数量充足、活性良好的骨髓间充质干细胞成为
国内外学者研究的重点。
❖
依据骨髓间充质干细胞对塑料培养瓶具有黏附贴壁特性，实验采用贴
❖ 经成骨诱导剂培养11 d后，细胞胞质内充满颗粒，细胞呈集落样生长，细胞 间可见钙质沉积，细胞结节中心的细胞融合失去细胞结构，钙结节形成明显，经 茜素红染色呈红色结节(图3B)；经碱性磷酸酶染色可见细胞外基质有大量紫褐色 沉淀，呈强阳性表达(图3C)；经vonkossa矿化染色可见细胞聚集处有黑色固块 ，岛状分布，呈强阳性表达(图3D)。骨髓间充质干细胞经成软骨细胞诱导剂培养 21 d后，诱导而成的软骨细胞变大、变圆，表面变的光滑，经甲苯胺蓝染色，可 见胞质呈蓝色(图3E)。骨髓间充质干细胞经成脂诱导剂培养19 d后，诱导而成的 脂肪细胞脂质累积，脂滴数量增加并相互融合，细胞由长梭形变为圆形、多边形 ，经油红O染色显示许多细胞的胞浆内有大量脂质沉淀(图3F)。
骨髓间充质干细胞表面标记物鉴定
❖ 取融合至90%左右生长状态良好第3代骨 髓间充质干细胞，胰蛋白酶消化、室温离心 、细胞计数，调整待测样本细胞数为1×109 L-1，分装至各PE管中，依次加入单克隆抗 体CD44、CD29、CD90、CD45、CD34、 CD11b，每管设立同型阴性对照组(对照组中 不加任何抗体)。常温避光孵育40 min，PBS 冲洗细胞，细胞重悬，经流式细胞仪检测分 析。
结果
刚接种于培养瓶的骨髓细胞大多数悬浮于培养液中，细胞呈圆形，大小不一。接种24 h后开始贴壁，通过更换培养液，去除悬浮未贴壁细胞，48 h后贴壁细胞逐渐伸展为梭形、多 角形、不规则圆形，排列不规则(图1A)。7 d后，贴壁细胞显著增多，以小圆形和梭形细胞为 多，部分细胞排列趋于平行，部分成旋涡状生长(图1B)。第3代骨髓间充质干细胞生长较原代 细胞快，以梭形细胞为主(图1C)。细胞传代至第8代，细胞增殖活力未见明显变化，主要以大
骨髓间充质干细胞的形态学观察
❖ 取原代和第8代细胞，每日用倒置相差显微 镜观察其生长形态及特征并照相记录。取生 长良好的细胞于含10%二甲基亚砜的血清中 冻存，2周后复苏，锥虫蓝拒染实验检测死亡 及存活细胞，继续于37 ℃，体积分数为 5%CO2培养箱中培养。
骨髓间充质干细胞生长曲线的绘制
❖ 取第1，3代细胞，胰酶消化后计数，以 5×104个/孔接种于96孔板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃，饱和湿度，体积分数为 5%CO2培养箱孵育2 h后，用酶联免疫检测 仪于450 nm波长下检测吸光度值。然后在检 测第1，2，3，4，5，6，7天同一时间作相 同检测。根据吸光度值绘制细胞增殖曲线。
壁法，建立一套简单、快速、有效的SD大鼠骨髓间充质干细胞分离培养
、增殖和纯化方法，观察其生长形态和生物学特性，验证其向成骨、成软
骨、成脂分化能力，为进一步研究骨髓间充质干细胞移植、基因治疗及组
织工程奠定实验基础。
实验方法
❖ 1、骨髓间充质干细胞的原代分离及传代培养 ❖ 2、骨髓间充质干细胞的形态学观察 ❖ 3、骨髓间充质干细胞生长曲线的绘制 ❖ 4、骨髓间充质干细胞表面标记物鉴定 ❖ 5、骨髓间充质干细胞多向诱导分化
骨髓间充质干细胞多向诱导分化
❖ 取生长良好的第3代骨髓间充质干细胞，以 5×107 L-1接种于24孔板，待细胞贴壁生长 融合至70%-80%时，向各诱导孔中分别加入 成骨细胞诱导剂(含地塞米松、β-甘油磷酸钠 、维生素C-2磷酸钠)，成软骨细胞诱导剂(含 地塞米松、转化生长因子β、维生素C)，成脂 细胞诱导剂(含地塞米松、胰岛素、吲哚美辛) 。各诱导孔定期换液，以未经处理的骨髓间 充质干细胞培养孔作为对照。