造血干细胞分离培养方法精编版
外周血中分离富集造血干细胞的方法
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造血干细胞分离实验
造血干细胞分离实验实验试剂与耗材含10％FCS的1640全培养基，Hank's溶液，磁珠，15ml与50ml离心管，相应抗体，2％胎牛血清的Hank's溶液（HBSS培养基，HF）实验步骤1.收集骨髓细胞时间8：40-10：57使用70％的乙醇清洁工作区及仪器颈部脱臼处死小鼠用70%乙醇浸湿小鼠，用来灭菌和降低污染可能。
无菌分离股胫骨，并将它们放入冰上含有2％胎牛血清的HBSS培养基（HF）中。
第一次细胞计数，得细胞，浓度为，总细胞为2. 密度梯度离心时间将细胞悬液室温下加在16mlFicoll溶液上方室温无级离心600g，30min（应为1900rpm，30min）将所用分离到的单核细胞（中间层）与上层Ficoll（试管中剩余5mlFicoll）转入50ml离心管中以下步骤均处冰上用50mlHBSS培养基（HF）洗涤细胞，并在4度400g离心5min（1800rpm，20min），用25mlHF重复洗涤一次(1600rpm,15min) 注意这两次离心降速均为无档降速用3mlHF将细胞悬起第二次细胞计数：取20ul细胞悬液，加入980ulHF或者480ul，混匀后，取20ul细胞加入20ul台盼兰溶液计数，得细胞ml，浓度为，总细胞为。
对照细胞1：未标记BM，上流式3. 抗系标记时间加入系标记抗体：根据抗体表，加入ul系标记抗体/1*108细胞4度混匀30min用25mlHF洗涤2次1600rpm，15min第三次细胞计数：取20ul细胞悬液，加入980ulHF或者480ul，混匀后，取20ul细胞加入20ul台盼兰溶液计数，得细胞浓度为，总细胞为对照2 和3：生物素标记的抗系抗体标记的BM ，上流式4. 用羊抗鼠免疫球蛋白磁珠去除系阳性细胞时间重新彻底悬起磁珠向每1ml 含有4⨯108磁珠的培养基中加入108细胞，使磁珠与细胞比在4：1（磁珠与细胞总体积必须小于8ml）将试管置混匀器，30min，4度同时准备对照染色所需抗体将磁珠与细胞转入15ml试管，加入8ml培养基，放入分离器用磁铁分离至少三次（去除磁珠）来收集上清再次洗涤磁珠一次，分离三次后，转入新管中将所有上清转入50ml离心管，400g，1600rpm，4度离心5min用1ml培养基重新悬起细胞5. 系阴性细胞用anti-Sca-1, c-kit标记时间加入10ul的阻断抗体，4度混匀器孵育15min。
造血干细胞分离培养方法
造血干细胞分离培养方法The manuscript was revised on the evening of 2021一造血干细胞分离（一）小鼠骨髓采集与单个核细胞悬液的制备1 HES(羟乙基淀粉)沉淀法抽取髓液500 m L按4∶1比例加入HES，自然沉降红细胞后，分离上清。
4℃400 g离心10 min得细胞沉淀物，以1 %白蛋白盐水液洗涤细胞2次。
2 percoll液密度梯度离心法①按体积比为～2)∶1在骨髓液中加入淋巴细胞分离液。
4℃,1 5 00 r / min，离心20 min。
取单个核细胞层，以1%白蛋白盐水液洗涤3次。
②取鼠股骨和胫骨 , 在两头关节处切开骨骼 , 反复用培养基冲洗骨髓腔 , 随后小心地逐滴将细胞悬液加在淋巴细胞分离液上 , 2 000 r / min 离心 20 min。
吸取离心后相交液面处的白色细胞层即为单个核细胞。
3 Ficoll分离法方法一在15ml分离管中加比重为的Ficoll液，缓慢移入等量骨髓细胞悬液，整体平衡后低温离心2000r/min×20min,吸取白细胞层，用RPMI1640液亲清洗后离心2000r/min×10min,取白细胞层加RPMI1640液到10ml制成造血干细胞悬液样本。
方法二取无菌离心管1支，预先添加3mlFicoll(与骨髓细胞悬液体积1:1)，用滴管取单细胞悬液3ml，沿离心管壁小心缓慢叠加于分离液面上，注意保持清楚的界面，室温下水平离心2000rpm×20分钟，（后续在冰上进行）用毛细吸管插到云雾层，小心吸取单个核细胞，置入另一短中管中，加入5倍以上体积的磷酸缓冲液PBS，1500rpm×10分钟，L-DMEM洗涤细胞两次，每次以1000r/min离心10min，去上清液。
（除第一步的室温离心外，其余为低温离心）。
取骨髓细胞悬液的方法是：取出大鼠腿骨将肌肉尽可能剔除，并用PBS缓冲液冲洗干净。
干细胞的分离与培养技巧指南
干细胞的分离与培养技巧指南干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，具有广泛的应用前景在组织工程、再生医学和药物研发等领域。
为了充分发挥干细胞的应用潜力，正确的分离和培养技巧显得尤为重要。
本文将为您介绍干细胞的分离与培养技巧，帮助您获得可靠的实验结果并提高实验效果。
一、干细胞的分离技巧1. 选择合适的组织来源干细胞可以从多种来源获得，包括胚胎干细胞、成体干细胞和诱导性多能干细胞。
根据研究目的和实验要求，选择适合的组织来源对于干细胞的分离至关重要。
例如，如果研究需要大量干细胞，胚胎干细胞可能是一个理想的选择；如果研究着眼于特定组织的再生，成体干细胞或诱导性多能干细胞可能更适合。
2. 采取正确的分离方法分离干细胞的方法有很多种，如机械分离、胶原酶消化和离心法等。
选择合适的方法要考虑细胞来源和实验要求。
机械分离主要适用于组织块的分离，胶原酶消化常用于组织细胞的分离，而离心法可以用于分离含有干细胞的细胞组分。
同时，在分离过程中要注意避免对细胞造成损伤，确保干细胞的活力和其它特性的保持。
3. 精确的筛选和鉴定干细胞分离干细胞后，对其进行准确的鉴定是必不可少的。
常用的鉴定方法包括细胞表面标记物的检测、形态学观察和功能性实验等。
通过这些方法可以确定干细胞的表型特征和功能特性，从而确认干细胞的纯度和活性，进一步提高实验的可靠性。
二、干细胞的培养技巧1. 选择适当的细胞培养基干细胞的培养基是维持其生长和增殖的基础。
不同类型的干细胞需要不同的培养基，包括支持细胞增殖的基础培养基和特定因子的补充培养基等。
选择适当的培养基要根据细胞类型和实验需求来确定，同时注意培养基的配方和浓度，确保提供足够的营养物质和生长因子。
2. 维持适宜的培养条件干细胞的培养需要维持适宜的环境条件，包括温度、湿度、气体氛围、培养器具和培养面积等。
一般情况下，干细胞的培养条件与正常体内环境相似，例如37℃的恒温、细胞培养箱中恒定的5% CO2和湿度控制等。
原代造血干细胞培养
原代造血干细胞培养
1. 细胞来源，造血干细胞可以从骨髓、外周血或者胎盘等多种来源获得，不同来源的细胞可能有不同的特性，需要根据实验目的选择合适的来源。
2. 细胞分离，从原代组织中分离出造血干细胞需要使用适当的分离方法，比如密度梯度离心、免疫磁珠分选等，以保证分离的细胞具有较高的纯度和活力。
3. 培养条件，原代造血干细胞在体外培养时需要提供适当的营养物质、生长因子和培养基，同时也需要控制适当的温度、湿度和气体环境，以提供良好的生长条件。
4. 培养监测，在培养过程中需要定期观察细胞的形态、增殖情况和表型特征，以及对细胞进行鉴定和纯度检测，确保培养的细胞符合实验要求。
5. 应用领域，原代造血干细胞培养在干细胞治疗、造血系统疾病研究、药物筛选等领域具有重要的应用前景，可以为相关疾病的治疗和研究提供重要的实验材料。
综上所述，原代造血干细胞培养是一项复杂而重要的实验技术，需要在细胞来源、分离方法、培养条件和监测等方面进行严格的操
作和控制，以确保获得高质量的细胞用于后续的研究和应用。
脐血造血干细胞分离方法
脐血造血干细胞分离方法说实话脐血造血干细胞分离这事，我一开始也是瞎摸索。
我试过好多方法呢，走了不少弯路。
我最早的时候啊，就按照一些书上那种很粗略的说法去做，感觉像是在黑暗里摸东西，根本找不着北。
那时候我想当然地觉得先把脐血收集起来，然后就开始用离心法，我想着这就跟淘米似的，把轻的杂质甩掉，重的干细胞就留下来呗。
结果啊，大错特错，根本不是那么回事。
这样做出来的东西杂质特别多，干细胞的纯度低得可怜。
后来我才知道，收集来的脐血里面成分复杂着呢，不是简单一离心就能搞定的。
再后来我就学乖了。
我在离心之前先进行了一定的预处理，这就好比给菜洗菜似的，先得把表面那些脏东西清理干净。
我会先往脐血里面加一些试剂，这些试剂呢就像是小刷子，能把那些可能影响分离的东西先给标记出来或者中和掉。
比如说，有些蛋白之类的东西会干扰干细胞分离，那这些试剂就能和它们起反应。
然后再进行离心操作就比之前好一点了。
但是这个离心也有讲究。
离心的速度和时间就像煮饭的火候一样，掌握不好可不行。
我试过不同的速度和时间组合。
速度快了时间长了，干细胞虽然能和大部分杂质分开，可是干细胞自身也会受到一定损伤。
速度慢了时间短了呢，又分不开。
我小心翼翼地调整，慢慢找到一个相对合适的范围，但是这个范围也不是固定死的，不同的脐血样本可能在这个基础上还需要微调。
还有一个我不断尝试的地方是过滤。
过滤就像是筛沙子，想把那些颗粒特别大的杂质筛出去。
开始我用的过滤装置孔径选择不好，不是把干细胞挡住了，就是让一些杂质也通过了。
后来经过各种尝试，才确定了比较合适的孔径大小。
不过呢，这个也不是对所有脐血都完全适用，还得根据具体情况来看。
另外，在整个分离过程中，环境因素也很重要。
温度就像给细胞盖的被子一样，如果不合适，细胞也会闹情绪。
我试过如果温度偏低一点或者偏高一点，最后得到的干细胞质量就是会有差别。
我现在明白了，做脐血造血干细胞分离啊，就得像照顾小孩子一样，方方面面都得考虑周到，一个小环节没做好就可能前功尽弃。
干细胞分离培养
2. 干细胞分离培养2.1胚胎干细胞诱导分化首先将类胚体消化成单细胞，贴壁培养，于不同的培养阶段添加不同种类和不同浓度的化学物质、条件培养基或细胞因子等诱导条件，直接促进ES细胞定向分化为某种特殊类型的细胞；或通过改变培养条件对某些类型的细胞分化起抑制作用，从而高效诱导目的细胞的分化。
改变细胞的培养条件使ES细胞进行定向分化的基本策略有三种：一是向培养基中添加生长因子和化学诱导剂等；二是将ES细胞与其它细胞一起进行培养；三是将细胞接种在适当的底物上，以促使细胞中某些特定基因的表达上调或下降，从而引发细胞沿着某一特定谱系进行分化。
体外诱导胚胎干细胞的物质有化学试剂诱导法、细胞因子诱导法和外源基因诱导法。
化学试剂诱导法：维甲酸（RA）、DMSO、β-磷酸甘油、维生素C(VC)、地塞米松、维生素K3(VK3)以及2，5-羟基维生素D3等化学试剂，都能诱导ES 细胞定向分化为特定类型细胞。
细胞因子诱导法：ES细胞在培养过程中对许多细胞因子具有很强的依赖性。
增加或减少一种或几种细胞因子可影响ES细胞的增殖或分化。
目前研究最深入的细胞因子主要有骨形成蛋白(BMPs)和成纤维细胞生长因子(FGF)等。
外源基因诱导法：转基因法可以弥补细胞因子法的不足。
其原理是使某个促分化基因在ES细胞中过度表达，从而调控ES细胞的分化。
应用此方法之前，首先要确定决定该细胞向不同方向分化的关键基因，其次还要确保在适宜的时间将此基因正确插入到ES细胞基因组序列上。
2.2肿瘤干细胞（CSC）分离鉴定对于CSC的分离纯化主要有根据细胞表型特征和生物学特性而建立的两大类方法：第一类：依赖于细胞表面标志的分离方法造血系统肿瘤干细胞：正常造血干细胞的表型为CD34+CD38+Thy-1-实体瘤肿瘤干细胞：A.乳腺癌：ESA+CD44+CD24-/LowLineage-的细胞是乳腺癌CSC。
B.脑肿瘤：将CD133+的肿瘤细胞命名为脑肿瘤干细胞(BTSC), 还表达Sox2、Musashi-1、bmi-1、磷酸丝氨酸磷酸化酶等神经干细胞和其它干细胞的基因特征C.结直肠癌：CD133+细胞是结直肠癌细胞的起始细胞。
造血干细胞体外培养
造血干细胞体外培养
在进行造血干细胞体外培养时，首先需要从骨髓、外周血或者
胎盘血等来源中获得含有造血干细胞的细胞样本。
然后，这些细胞
样本会被经过特定的处理和分离步骤，将造血干细胞分离出来。
接
下来，这些分离出来的造血干细胞会被放入含有适当营养物质和生
长因子的培养基中进行培养。
培养基的配方和条件需要精确控制，
以提供细胞增殖和生长所需的理想环境。
在体外培养的过程中，研究人员需要定期检测和评估造血干细
胞的生长状态、纯度和活性。
他们可能会对培养条件进行调整，以
确保造血干细胞能够在体外保持其干细胞特性和功能。
造血干细胞体外培养的成功对于临床移植和疾病治疗具有重要
意义。
通过体外培养，可以获得足够数量和质量的造血干细胞，用
于移植到需要再生造血系统的患者体内，如白血病或骨髓衰竭患者。
此外，体外培养也为研究人员提供了研究和了解造血干细胞生物学
特性的重要工具，有助于深入探究造血系统疾病的发病机制和开发
新的治疗方法。
总的来说，造血干细胞体外培养是一个复杂而重要的过程，它
在临床和科研领域都具有重要意义，对于促进医学进步和治疗疾病具有深远影响。
造血干细胞体外培养
造血干细胞体外培养
首先，造血干细胞体外培养的过程通常涉及到从骨髓、外周血或者脐带血等来源中分离出造血干细胞。
这些干细胞随后会被置于含有适当营养物质和生长因子的培养基中进行培养。
培养基的配方需要精确控制，以提供适当的营养和环境条件来促进干细胞的增殖和分化。
其次，体外培养的过程中需要严格控制培养条件，包括温度、湿度、氧气浓度等因素。
这些条件对于干细胞的生长和分化至关重要，因此需要精确监控和调节。
此外，体外培养的过程也需要考虑到细胞的纯度和活性。
在培养过程中，需要定期检测和评估干细胞的纯度和活性，以确保其符合临床应用的要求。
在实际应用中，体外培养的造血干细胞可以用于干细胞移植，用于治疗白血病、淋巴瘤、贫血等血液系统疾病。
此外，体外培养的造血干细胞也被用于研究干细胞生物学以及药物筛选等领域。
总的来说，造血干细胞体外培养是一项复杂而重要的技术，它
为干细胞移植和血液系统疾病治疗提供了重要的支持，同时也推动了干细胞生物学和临床应用的发展。
随着技术的不断进步，相信体外培养技术将在未来发挥更加重要的作用。
造血干细胞表型及分离纯化方法
02
不同部位AA的长度为：
所谓表位是指同一抗原分子上有不同的抗原识别位点。目前有My-10, BI-3c5, 12.8, ICH-3, TUK , 115.2 等单抗识别的位点。前四株识别的表位取决于 sialic acid residues, 后二者却不 一样。
01
CD34分子的epitopes
hematopoietic stem and progenitor cells. neural and embryonic stem cells. some leukemias and brain tumours that may be derived from stem cells. Low level expression could also be detected in the kidney, pancreas, placenta, and fetal liver.
CD34+CD10+CD19+ (前B)；
CD34+CD5+CD7+ (前T)；
CD34+CD71+CD45RO+ (红前)；
CD34+CD41+(巨前)；
CD34+CD13+CD33+CD45RA+ (髓前)
不同CD34阳性细胞亚群
较原始干细胞亚群的免疫表型一般为：
(Rhodamine 123 Dull)
推测，在造血早期，CD34分子的作用可能与干细胞之间或干细胞与基质细胞之间的接触、通信和相互作用有关。
01
02
(2) 细胞间接触、通信和相互作用
Civin小组证实，CD34可由激活的PKC迅速磷酸化，激活的PKC能刺激CD34阳性前体细胞CD34上调，这种上调独立于内质网内CD34的转录和转换。可见，CD34磷酸化是细胞表面上调的扳机，PKC活化是生长因子配体-受体结合启动胞浆信号转导级联的一个成分。
造血干细胞培养
造血干细胞培养造血干细胞是一类具有自我更新和分化能力的细胞，能够持续产生各种成熟的血细胞。
在人体造血系统中，造血干细胞起着至关重要的作用，它们能够不断地分裂和分化，以满足机体对血细胞的需求。
然而，由于某些疾病或外界因素的干扰，造血干细胞的功能可能受到损害，这就需要进行造血干细胞的培养。
造血干细胞培养是指在体外人工培养条件下，利用特定的培养基和因子，使原始的造血干细胞能够持续增殖和分化，以获得大量的干细胞。
这种培养技术的发展，为临床治疗提供了重要的资源和方法。
造血干细胞培养的关键是提供适宜的培养环境和因子。
首先，培养基的选择非常重要。
培养基中应包含适当的营养物质和生长因子，以支持干细胞的生长和分化。
同时，培养基还应具备维持细胞健康和增殖的功能。
现在，已经开发出多种不同的培养基，如StemPro® HSC Expansion Medium和X-VIVO 10等，可以满足不同类型的干细胞的需求。
培养过程中的因子也是至关重要的。
这些因子能够促进干细胞的增殖和分化。
常用的因子包括血小板衍生生长因子（PDGF）、骨髓基质细胞衍生生长因子（SCF）、造血细胞因子（HSC）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）等。
这些因子可以通过添加到培养基中，提供给细胞，以促进其增殖和分化。
在培养过程中，还需要注意对细胞的处理和培养条件的控制。
首先，需要从合适的来源中获取到造血干细胞，如骨髓或外周血。
然后，通过特定的方法分离和富集干细胞，以获取纯度较高的种群。
接下来，将干细胞种植到预先准备好的培养基中，进行培养。
在培养过程中，需要控制培养皿的温度、湿度和氧气浓度等条件，以提供适宜的环境。
在培养过程中，可以通过不同的方法监测细胞的增殖和分化情况。
常用的方法有流式细胞术、定量PCR和免疫组织化学等。
这些方法可以帮助研究人员了解细胞的状态，并进行进一步的调控。
造血干细胞培养的应用非常广泛。
首先，它可以用于临床治疗。
对于一些血液系统的疾病，如白血病、再生障碍性贫血等，造血干细胞移植是一种常用的治疗方法。
分离培养干细胞的方法分类
分离培养干细胞的方法分类
分离培养干细胞的方法主要可以分为以下几类：
1. 最常见的方法为机械分离法，利用组织或细胞的物理性质进行分离。
例如在骨髓中分离造血干细胞时，可以利用胶体或其他分离物质将骨髓细胞进行分层，然后将不同层次的细胞进行分离。
2. 免疫选择法，利用单克隆抗体的特异性结合，将目标细胞从混合细胞中分离出来。
例如在胎盘组织中分离胚胎干细胞时，可以利用特异性的单克隆抗体识别胚胎干细胞表面的记号分子，然后利用磁性微珠等手段将这些细胞分离出来。
3. 化学处理法，利用化学或药物物质的特性，直接或间接地影响目标细胞的生长与分裂。
例如在胚胎干细胞的培养中，可以利用衍生自自然化合物的小分子化合物，来调控细胞的生长与分裂。
4. 细胞团块培养法，利用干细胞的自我复制和自我更新的特点，在培养基中形成球状细胞团，然后分离出内部细胞团中的干细胞。
例如在胚胎干细胞的分离中，可以将早期发育阶段胚胎的内细胞团分离出来进行培养。
以上是几种干细胞分离与培养方法的分类和简要介绍。
7.造血干细胞表型及分离纯化方法
较差，完全缓解率及存活率低，传统的
化疗方案治疗效果可能不好。
4.CD34阳性细胞亚群
根据细胞表面抗原表达的情况，可 将CD34阳性细胞分为许多亚群，这些细 胞多数已定向到特定细胞系。 与CD34共表达，可作为干细胞进一 步分型依据的抗原有：CD38、CD10、 CD19、CD5、CD7、CD71、CD45、 CD41、CD13、CD33等。
MACS-isolated CD133+ cells became adherent and CD133- during cultivation, but gave rise to nonadherent CD133+ cells budding from the adherent cell surface by a symmetric cell division. Cells were stained with CD133/1 (AC133)-PE.
之后，其他研究小组也相继研制 出12.8; BI-3c5; ICH-3等类似抗体。 1986年，这些抗体被命名为CD34， 为目前公认的干细胞的重要标志。 CD34抗原的发现促进了造血干 细胞研究的深入和发展，是一重要的 里程碑事件。
本次课的主要内容
一.造血细胞的表型 CD34；Sca-1；Thy-1；Lin-；c-kit 二.造血细胞分离方法 FACS；磁柱分离；亲合分离； Panning
97kDa的糖蛋白，包括5个跨膜结 构域， 糖基化后在蛋白胶上显示120 kDa的蛋白带。最初是通过AC133单抗 鉴定的，它能识别人HSCs的CD34+亚 类29,30。一种CD133异构体AC133-2, 最近已经被克隆并鉴定为可被AC133抗 体识别的原始表面抗原。
人骨髓造血干细胞的分离培养
人骨髓造血干细胞的分离培养是一个复杂而重要的过程，涉及到细胞生物学、分子生物学和生物工程等多个领域。
以下是对该过程的详细描述，共计800字。
一、分离骨髓造血干细胞首先，我们需要从捐献者的骨髓中分离出造血干细胞。
通常，捐献者需要接受全身麻醉，然后在医生的监督下抽取一定量的骨髓。
抽取的骨髓样本经过处理后，会分离出造血干细胞和其他类型的细胞。
这一过程通常需要使用到离心技术，如密度梯度离心法。
二、培养造血干细胞分离出的造血干细胞需要在一个适合它们生长和分化的环境中进行培养。
实验室环境通常需要具备以下几个条件：1. 合适的营养物质：造血干细胞需要特定的营养物质来维持它们的生长和分化。
这些营养物质包括氨基酸、葡萄糖、维生素、矿物质和生长因子等。
2. 适合的pH值和渗透压：造血干细胞对环境的pH值和渗透压非常敏感。
过高的pH值或渗透压可能导致细胞死亡或停止生长。
3. 适合的温度：温度是影响细胞生长和分化的重要因素。
适宜的温度可以使造血干细胞保持最佳的分裂状态。
在培养过程中，造血干细胞会逐渐分裂并形成更多的细胞，同时也会分化为不同类型的血细胞，如红细胞、白细胞和血小板等。
为了确保造血干细胞的生长和分化，通常会使用一些细胞因子，如集落刺激因子（CSF）和红细胞生成素（EPO）等。
这些细胞因子可以刺激造血干细胞增殖并抑制其分化为非造血细胞。
三、观察和记录在培养过程中，我们需要密切关注细胞的生长状况，并定期进行观察和记录。
可以通过显微镜观察细胞的形态变化，测量细胞生长的速度和数量，以及检查细胞分化的程度。
通过这些观察结果，我们可以了解细胞的生长状态，及时调整培养条件，以确保造血干细胞的最佳生长。
四、提取和分析干细胞克隆当造血干细胞在适当的条件下生长和分化时，可能会形成独立的细胞克隆。
这些克隆可以用于进一步的研究和药物开发。
可以通过克隆培养、基因敲除、基因表达分析等方法对干细胞克隆进行深入研究。
这些研究可以帮助我们更好地了解造血干细胞的生理特性，并为相关疾病的治疗提供新的思路和方法。
造血细胞分离、集落培养及表型分析
造血细胞分离、集落培养及表型分析动性好，同时也避免了细胞因受力而损伤的情况。
流式细胞仪通过激光束照射细胞，检测细胞表面标记物的荧光强度，进而分析细胞表型，包括细胞表面标志、大小、形态等。
2、集落培养集落培养法是一种常用的检测造血干细胞的方法。
将待测细胞在半固体培养基中培养，待细胞分裂形成集落后，根据集落的形态和数量来判断细胞的分化能力。
常用的集落包括粒-巨嗜细胞集落形成单位（CFU-GM）、红系爆式集落形成单位（BFU-E）、巨核细胞集落形成单位（CFU-MK）等。
集落培养法可以检测细胞的增殖能力和分化潜能，是评估细胞功能的重要方法。
二、实验步骤1、细胞样品制备将待测细胞制成单细胞悬液，使得细胞可以均匀地分布在流式细胞仪的流动室中，方便后续的细胞表型分析。
2、流式细胞仪分析将制备好的细胞悬液加入样品管中，加入特异性荧光染料后，通过流式细胞仪进行细胞表型分析。
根据细胞表面标志物的荧光强度，可以判断细胞的类型和状态。
3、集落培养将待测细胞在半固体培养基中培养，待细胞分裂形成集落后，根据集落的形态和数量来判断细胞的分化能力。
常用的集落包括粒-巨嗜细胞集落形成单位（CFU-GM）、红系爆式集落形成单位（BFU-E）、巨核细胞集落形成单位（CFU-MK）等。
三、实验结果分析通过流式细胞仪和集落培养的结果，可以分析细胞的表型和功能。
例如，CD34+、CD38-、HLA-DR-、Thy-1+、c-kit+、LFA-1-、CD45RA-、CD71-、lin-等标志物被广泛认为是造血干细胞的标志。
同时，集落培养的结果也可以评估细胞的增殖能力和分化潜能。
这些结果对于研究造血干细胞的生物学特性和临床应用具有重要意义。
本实验采用流式细胞仪技术对脐血中的造血干细胞进行分离和检测。
流式细胞仪的测量区利用样品流和鞘流的气压差的层流原理，使细胞依次排列成单行，每个细胞以均等的时间依次通过测量区。
被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照射后发出荧光，同时产生散射光。
哺乳动物骨髓造血干细胞的分离与鉴定
哺乳动物骨髓造血干细胞的分离与鉴定生命的奥秘在于细胞的复制、分化和成长。
骨髓是细胞成长的主要场所，成熟的血细胞在其中产生并释放到血液中。
然而，这些血细胞的前身——骨髓造血干细胞，一直是医学上的一项重要研究对象。
骨髓造血干细胞具有干细胞特性，可以自我更新，同时也能分化为多种类型的血细胞，如红细胞、白细胞和血小板等。
因此，对骨髓造血干细胞的分离与鉴定具有重要的意义。
1.骨髓造血干细胞的分离方法骨髓造血干细胞的分离方法较为多样，包括体外培养、细胞贴壁法以及酶消化法等。
其中，酶消化法最为普遍，常用的酶有胰蛋白酶、胰酶、玻璃纤维素酶等。
以玻璃纤维素酶为例，其分离过程如下：①先用PBS洗涤骨髓细胞，抛弃洗涤液；②加入玻璃纤维素酶，并摇晃孵育2h；③过滤，然后以停滞法分离骨髓造血干细胞。
2.骨髓造血干细胞的鉴定方法骨髓造血干细胞的鉴定方法包括形态学、免疫学和功能学等。
其中，免疫学是鉴定的主要手段，常用的方法有流式细胞术、免疫组织化学和细胞培养等。
以流式细胞术为例，其鉴定过程如下：①先用PBS洗涤骨髓造血干细胞，然后加入荧光抗体；②静置冷藏20min，洗脱、离心、抛弃上清液；③加入荧光剂，室温反应30min；④洗脱、离心、抛弃上清液，加入PBS洗涤；⑤用流式细胞术进行检测。
3.骨髓造血干细胞在治疗方面的应用骨髓造血干细胞在治疗方面的应用广泛，包括造血细胞移植、免疫治疗、组织修复等。
在造血细胞移植中，骨髓造血干细胞可以取代患者的骨髓，进行更新和修复；在免疫治疗中，骨髓造血干细胞可以针对疾病进行特异性免疫应答；在组织修复中，骨髓造血干细胞可以分化为各种类型的细胞，进而完成组织和器官的修复。
总之，骨髓造血干细胞的分离与鉴定对于临床治疗及医学研究具有重要意义。
随着科学技术的不断进步，人们对骨髓造血干细胞的认识和利用将会越来越深入，在医学领域发挥更加广泛的作用。
血细胞分离培养
血细胞分离培养以前认为红细胞、粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等血细胞都属终末分化细胞, 很难在体外培养生长或仅能短期培养而不能传代, 近年来由于细胞培养技术的发展, 已有血细胞培养成功的报道, 正常血细胞在体外培养生长时间短, 只有白血病细胞, 血友病细胞、淋巴瘤细胞可培养成功并建立细胞系, 但多半为EB 病毒等致瘤病毒引起的转化细胞, （EBNA检查阳性）, 二甲基亚砜（DMSO ）处理也可诱导这些细胞分化发生逆转, 表现为正常细胞. 所建立的细胞系多半为单核细胞系、B 淋巴细胞系、T 淋巴细胞系, 只在IL-2 产品问世后,T 细胞才可在体外建系、建株.血细胞可从外周血中用梯度液通过离心分层后分离获得. 也可从脾脏、扁桃体、淋巴结中用机械法切碎过筛分离获得淋巴细胞, 从腹腔刺激后的冲洗液中可获得大量的单核- 巨噬细胞, 从骨髓中可以获得前提血细胞, 并可长期培养生长. 加入生长因子或某些物质有利于细胞纯化并促进分化和生长繁殖, 例如在淋巴细胞中加入IL-2 （TCGF ）, 可促进T 细胞生长, 建立T 淋巴细胞系. 在多发性骨髓瘤细胞（B 细胞）培养中, 加 B 细胞生长因子, 可建立 B 细胞系；加入IL-6 （或正常淋巴细胞培养48h 的培养上清中的IL6 ）可使 B 细胞在体外长期培养, 建立了IL-6 依赖的B9 细胞系. 在骨髓单个核细胞培养中加入二羟基维生素D3, 可使单个核细胞分化为成骨细胞及破骨细胞.（一）外周血细胞分离：外周血中除红细胞外, 还有粒细胞、单核细胞和淋巴细胞及血小板等, 通常是分离这些血细胞的重要来源. 其分离方法有四种：自然沉降法、差异沉降法、氯化铵分离法、Ficoll 分离法.1 、自然沉降法：将无菌抗凝血放入试管中, 在37 ℃水浴中静置, 自然沉降1-2h, 可见到红细胞下沉, 并有明显分层, 上层血浆中富含有大量的和淋巴细胞, 下层主要为红细胞. 此方法简便但各层中的细胞种类多, 不纯. 血浆中虽以粒细胞、淋巴细胞为主, 但也含有血小板, 大单核细胞和少量红细胞. 下层虽以红细胞为主, 但也有上述各种细胞, 此法适用于淋巴细胞转化试验.2 、差异沉降法：用6% 的右旋糖酐或3% 的明胶溶液无菌消毒后, 分装于中试管中, 由于这些物质能使红细胞形成“串状”, 比粒细胞、淋巴细胞沉降速度快, 因而可使红细胞与白细胞、淋巴细胞分离开. 其方法如下：用6% 的右旋糖酐溶液5-10ml, 经抗凝血5ml 加入上层中混合后静置于37 ℃水浴中30-60min, 即可见红细胞下沉, 上层富含大量粒细胞和淋巴细胞, 下层为红细胞, 使两者易于分离开, 取上层可用于粒细胞、淋巴细胞培养和实验, 下层可用于红细胞培养和实验, 经PBS 洗 3 次后即可加入培养基培养, 可用于天然白细胞干扰素的诱生和生产. 此法分离的细胞纯度也不高.3 、氯化铵分离法：0.83% 氯化铵（NH4CL ）可使红细胞破裂, 通常将分离获得的粒细胞. 淋巴细胞中混有的少量的红细胞用0.83% 氯化铵进行裂解, 以排除红细胞的干扰. 另外, 此法也适合大量粒细胞、淋巴细胞的分离制备, 在天然白细胞干扰素诱生和生产中已被广泛应用. 方法如下：将中心血站供应的健康人外周血离心分离白细胞黄层悬液先经2000r/min 离心20min, 吸出上清血浆, 将下层的红细胞、白细胞混合后, 加入0.83 氯化铵, 用量为血细胞悬液液量的 3 倍, 于 4 ℃作用20min 后离心弃去上清.在沉淀层中再加入新鲜0.83 氯化铵混匀后于 4 ℃作用20min, 以便彻底清除红细胞, 离心弃上清.收货下层的细胞用PBS 洗3 次后, 再用含5% 人AB 型血清的（含100U/ml 卡拉霉素）培养基制成悬液, 调整细胞浓度为（8-10 ）x10^9 个/L, 分瓶加塞在37 ℃普通培养箱中旋转培养（12r/h ）.混悬细胞时若加入干扰素诱导剂（NDV-F ）诱导22h, 收货上清就可生产白细胞干扰素. 此法分离的细胞纯度更差.4 、Ficoll 分离法：采用Ficoll 和泛影葡胺配制而成的淋巴细胞分离液, 通过2000r/min 离心后可使血细胞以不同相对密度分离开, 如分离淋巴细胞可选用相对密度1.077 的分离液；若分离血小板可用相对密度 1.090 的分离液, 若分离骨髓中的单核细胞常用相对密度 1.120 的分离液, 现以淋巴细胞分离为例, 方法如下.取中心血站供应的抗凝血细胞或初步分离的白细胞黄层细胞悬液, 用无钙、镁离子的PBS 稀释3-4 倍.将Ficoll 淋巴细胞分离液事先分装于离心管中, 使其沉于管底, 并在37 ℃中预热.用吸管将经稀释的血细胞悬液沿离心管壁缓慢加入, 不让细胞悬液冲破分层液界面, 使其悬于分层液上方.以2000r/min 离心20min 后, 不同细胞可依相对密度不同而分布于各位置上, 由于红细胞在Ficoll 作用下成串下沉, 故在离心管中分布在Ficoll 层下方, 淋巴细胞分布在Ficoll 层上方.收集浑浊带分离获得的淋巴细胞, 用无钙、镁离子的PBS 洗3 次后, 再用培养基洗1 次后计数, 分瓶培养.此法分离获得淋巴细胞纯度高.分离液的制备：9% Ficoll （20 ℃下相对密度约1.020 ）24 份与33.4% 泛影葡胺（用泛影钠或Conray400 也可, 在20 ℃下相对密度约1.200 ）10 份混合后, 将其相对密度调至 1.077 金额可获得淋巴细胞分离液, 于121 ℃高压蒸汽灭菌30min, 室温保存备用. 若配制高相对密度的分离液用加入高浓度泛影葡胺来调整, 若配制低相对密度的分离液用稀释的Ficoll 来调整.（二）淋巴器官中淋巴细胞的分离：从脾脏、淋巴结、扁桃体或胸腺等器官中制备淋巴细胞悬液, 在免疫学研究中是经常用到的. 方法如下.无菌取上述淋巴器官, 若为扁桃体, 应将扁桃体在剥离外表的结缔组织和血块后, 在含高浓度抗生素的洗液中 4 ℃浸泡2-4h, 以防污染.将淋巴器官剪成碎块, 用镊子压挤碎块, 或在金属丝网上研磨, 用洗液冲洗, 或用玻璃匀浆器研磨, 制成悬液.自然下沉10min 后, 吸取上层细胞悬液, 弃去下层沉淀的组织块,1500r/min 离心, 取沉淀物, 用无钙、镁离子的PBS 洗 2 次后, 混悬于培养基中, 分瓶培养.用上述分离法所获得的拎包细胞, 可用于白细胞黏附移动试验、转化试验、细胞毒试验, 同时可用于细胞因子的诱生和制备, 或扩增外周血造血细胞、树突细胞、淋巴因子激活杀伤细胞(LAK 细胞) 、T δ细胞等, 供细胞移植用.（三）人脐带血细胞分离培养：人脐带血来源方便, 采集容易, 对母婴均无伤害. 近年来研究表明, 脐带血的血浆中富含许多高水平的造血活性物质, 具有刺激和促进骨髓造血干/ 祖细胞增殖、分化和再植能力的功能, 是造血生长因子的重要来源.脐带血中富含类似于骨髓的造血干细胞, 其中CFU-G 、BFU-E 、CFU-GM 近似或高于正常成人骨髓和外周血中的造血干/ 祖细胞, 比骨髓更原始, 具有很强的自我复制和再植能力. 脐带血中还含有类似于骨髓的基质细胞, 对骨髓造血具有支持作用, 在体外培养扩增中具有更大的增值能力, 是造血干细胞的理想来源, 已被应用于Fanconi 贫血、某些白血病和恶性肿瘤的治疗, 并容易获得骨髓造血功能的重建.随着脐带血造血功能研究的不断深入, 为体外培养和扩增脐带血干/ 祖细胞建立了切实可行的方法.健康产妇于新生儿娩出后立即断脐, 用含抗凝剂的采血装置无菌采集正常足月顺产儿脐带血, 一般可采集50-80ml.将脐带血用无钙、镁离子的PBS 稀释2-3 倍, 缓慢沿壁轻轻加入含Ficoll-Hypque 淋巴细胞分离液的离心管中, 注意加样时切勿冲破分层界面,2500r/min 离心25min.收集单核- 淋巴细胞层细胞, 先用PBS 洗2 遍, 再用培养基洗 1 次, 活细胞计数, 存活率应大于90% 以上.将分离获得的脐带血单个核细胞（MNC ）, 浓度109 个/L, 用含5%AB 型血清（或10% 脐带血）的RPMI1640 培养基, 外加10mg/ml 干细胞因子（SCF ）、10ng/mlIL-6 和IL-3 、2U/mlEPO 、10ng/ml 的G-CSF 和GM-CSF, 置于37 ℃、5%CO2 下进行培养.每周半量换液一次, 共培养 5 周.10 天左右可传代培养, 不断使脐带血中的单个核下拨进行扩增, 培养 5 周, 可使单个核细胞数增加252 倍, 同时了检测造血干细胞中CD34+ 细胞的比例, 经检测,CD34+ 细胞增加250 倍. 一般脐带血中MNC 体外扩增 2 周即可满足一个成人造血干细胞移植的需求.若在分离获得的脐带血单个核细胞中, 用含20% 小牛血清的ROMI1640 培养基外加二羟基维生素D3 、地塞米松、维生素C 等刺激物, 培养1-2 周后, 可见有贴壁基质细胞的生长形态（呈梭形、多角形）, 说明脐带血中基质细胞可支持造血干细胞生长. （四）巨噬细胞分离培养：巨噬细胞有多种功能, 是免疫应答中重要的抗原递呈细胞, 是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象. 该细胞易获得, 便于培养. 人巨噬细胞难以长期生长, 多用作初代培养. 目前所建立的无限细胞系大多来自小鼠, 如P388D-1 、J774A-1 、RA W309 、Cr-1 等均以恶性化, 但仍保留原有形态和吞噬功能, 易于传代和脱壁分离.巨噬细胞可来源于人胸水、腹水、血和透析液等, 实验动物多从血液、肺、脾和胸腔、腹腔获取, 通常预先注入刺激物后再采集, 以小鼠腹腔取材法最为实用, 方法如下. 实验前 3 天向每只小鼠腹腔注入肉汤培养基1ml.引颈杀死小鼠, 手提尾将全鼠浸入70% 酒精中浸泡3-5s.置动物于解剖台上, 用针头固定四肢, 剪开腹部毛皮, 双手用镊子撕开皮肤拉向两侧, 暴露出腹膜, 切勿撕破腹膜.用70% 酒精棉球擦洗腹膜后, 用注射器吸10mlEagle 液注入腹腔中, 同时从两侧用手指揉压腹膜壁, 使液体在腹腔内充分流动.用针头轻轻挑起腹壁, 将动物微倾向一侧, 是腹腔中液体集中于针头下吸入针管内.小心拔出头, 将液体注入离心管中,1500r/min 离心10min 去上清, 加10mlEagle MEM 培养基洗2-3 次后计数.每只小鼠可产生（2-3 ）x10^7 个细胞, 其中90% 为巨噬细胞, 以2.5x109 个/L 接种培养.为纯化巨噬细胞, 去除其他白细胞, 接种数小时后, 待巨噬细胞预先充分贴壁, 此时去除原培养基, 并用Eagle 液洗瓶壁1-2 次, 再加入新Eagle MEM 培养基, 置37 ℃、5%CO2 温箱中培养.。
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造血干细胞分离培养方
法精编版
MQS system office room 【MQS16H-TTMS2A-MQSS8Q8-MQSH16898】
一造血干细胞分离
（一）小鼠骨髓采集与单个核细胞悬液的制备
1 HES(羟乙基淀粉)沉淀法
抽取髓液500 m L按4∶1比例加入HES，自然沉降红细胞后，分离上清。
4℃400 g离心10 min得细胞沉淀物，以1 %白蛋白盐水液洗涤细胞2次。
2 percoll液密度梯度离心法
①按体积比为～2)∶1在骨髓液中加入淋巴细胞分离液。
4℃,1 5 00 r / min，离心20 min。
取单个核细胞层，以1%白蛋白盐水液洗涤3次。
②取鼠股骨和胫骨 , 在两头关节处切开骨骼 , 反复用培养基冲洗骨髓腔 , 随后小心地逐滴将细胞悬液加在淋巴细胞分离液上 , 2 000 r / min 离心 20 min。
吸取离心后相交液面处的白色细胞层即为单个核细胞。
3 Ficoll分离法
方法一在15ml分离管中加比重为的Ficoll液，缓慢移入等量骨髓细胞悬液，整体平衡后低温离心2000r/min×20min,吸取白细胞层，用RPMI1640液亲清洗后离心2000r/min×10min,取白细胞层加RPMI1640液到10ml制成造血干细胞悬液样本。
方法二取无菌离心管1支，预先添加3mlFicoll(与骨髓细胞悬液体积1:1)，用滴管取单细胞悬液3ml，沿离心管壁小心缓慢叠加于分离液面上，注意保持清楚的界面，室温下水平离心2000rpm×20分钟，（后续在冰上进行）用毛细吸管插到云雾层，小心吸取单个核细胞，置入另一短中管中，加入5倍以上体积的磷酸缓冲液PBS，1500rpm×10分钟，L-DMEM洗涤细胞两次，每次以1000r/min离心10min，去上清液。
（除第一步的室温离心外，其余为低温离心）。
取骨髓细胞悬液的方法是：取出大鼠腿骨将肌肉尽可能剔除，并用PBS缓冲液冲洗干净。
在超净台中腿骨浸泡在PBS缓冲液中5min，之后在两头关节处切开骨骼 , 反复用PBS缓冲液冲洗骨髓腔，从而得到骨髓细胞悬液。
（二）Linc-- kit+造血干细胞的分离纯化。
去除 Lin+细胞( 负筛选) : 带有生物素的混合抗体标记成熟细胞 ; 抗生物素的磁珠吸附抗体标记的成熟细胞 , 包括 T , B淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞以及它们的定向前体细胞 ; 细胞通过磁场不被柱子吸附的包括造血干细胞和骨髓间质干细胞。
收集CD117+细胞( 正筛选)：带有CD117抗体的磁珠吸附CD117+细胞 , 细胞通过磁场被柱子吸附的CD117+细胞(具体操作步骤参照M iltenyi公司MACS手册)。
（三）根据细胞表面CD34+抗原进行分离纯化
流式细胞仪检测骨髓CD34+细胞：取50μL细胞悬液 , 加入μL CD45- FITC和10μL CD34- PE充分混合 , 避光孵育15 min。
以PBS液洗涤并加多聚甲醛固定液450μL固定 , 上机检测。
磁性标记 CD34+细胞：在细胞悬液中加入100μL Fc - R阻滞剂 , 再加入100
μLCD34 磁珠标记细胞 , 于4℃冰箱中充分混合孵育 30 min。
用PBS 缓冲液洗涤细胞，离心10 min , 去上清液后再以500μL PBS缓冲液重新悬浮细胞。
MiniMACS磁性分离、纯化CD34+细胞：将MS分离柱放置在MACS分离器的磁场中，以500μL PBS缓冲液漂洗。
以孔径30μm的尼龙网或过滤器去除细胞悬液凝块 , 细胞通过分离柱 , 以500μL PBS 缓冲液冲洗 3次。
将分离柱从分离器中移出并放置在合适的试管中 , 于分离柱顶端滴注P BS 缓冲液 1 m L, 用分离柱配备的活塞加压将保留的细胞冲出。
重复磁性分离步骤，将洗脱的细胞移至一个新的漂洗过的MS分离柱洗涤，用500μL PBS 缓冲液洗脱保留的细胞。
二造血干细胞培养
1 粒-巨噬细胞集落生成单位(GFU-GM)培养（CD34+细胞的培养）
采用甲基纤维半固体培养基体系进行集落培养。
培养体系中含有50μg / L重组干细胞生长因子( rhSCF)、10μg / Lrh GM-CSF、10μg / L重组白细胞介素( rhIL) -3。
在1 mL培养体系中加入1×105个有细胞。
5 %CO2 , 37℃条件下培养14 d , 倒置显微镜下计数CFU-GM集落数。
2 MNCs与HSCs的体外培养
（1）MNCs体外培养：用含10 %小牛血清的高糖DMEM培养基培养 , MNCs以5×104个/ mL接种于24孔板中，每孔1 mL；(2)HSCs体外培养：用无血清高糖DMEM培养基，HSCs以1×104个/ mL 接种于24孔板中。
细胞均置37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养。
3 由MNC制备基质细胞层
取新鲜分离的单个核细胞1×106培养于1ml含10%胎牛血清的IMDM中,置于24孔培
养板中,于5%CO2,37℃饱和湿度的CO2孵育箱中,每7天半量换液1次,3周后培养孔底
铺满了基质细胞,去除悬浮细胞,用PBS洗2遍后,用含有EDTA的胰蛋白酶消化,1500RD
照射后将1x104/ml基质细胞移种于24孔板中,每孔1ml,继续培养2天备用。
4 由CD34+细胞制备基质细胞层
取新鲜分离的脐血CD34+细胞1x105培养于1ml无血清培养液(SCGM)中，加入细胞因子
FL+TPo+GM-IL-1+IL-6，细胞因子浓度为FL50ng/ml，TPO50ng/ml，GM一CSF、IL-1
和IL-6分别为10ng/ml，置于24孔培养板中，于5%CO
2，37℃饱和湿度的CO
2
孵育
箱中,
每7天半量换液1次，3周后培养孔底铺满了基质细胞，去除悬浮细胞，用PBS洗2遍后,
用含有EDTA的胰蛋白酶消化，1500拉德照射后将1xl了/ml基质细胞移种于24孔板中，
每孔1ml，继续培养2天备用。