脂肪干细胞分离培养指南
脂肪干细胞制备
脂肪干细胞制备
1、准备手术器械，进行严格消毒处理。
2、在手术过程中，医生将通过局部麻醉药对抽脂部位进行麻醉。
3、使用注射器将肿胀液（含有局麻药和生理盐水的混合物）注射
到脂肪层中。
4、使用吸引器将脂肪组织吸取出来，并将其收集在一个容器中。
5、对收集到的脂肪组织进行过滤和清洗，以去除其中的血液、肿
胀液和杂质。
6、将处理后的脂肪组织中的单个细胞分离出来，并将其培养在特
定的培养基中。
7、在培养基中添加一些生长因子和营养物质，以促进脂肪干细胞
的增殖和分化。
8、培养过程中需要进行多次换液和清洗，以确保细胞的健康生长。
9、在培养过程中，脂肪干细胞将逐渐增殖并分化成不同类型的细
胞，如成纤维细胞、内皮细胞和神经细胞等。
10、最后，将培养好的脂肪干细胞进行冷冻保存，以备后续使用。
脂肪间充质干细胞提取方法
脂肪间充质干细胞提取方法脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs）是一种广泛存在于人体脂肪组织中的多潜能干细胞。
由于其易于获取、丰富来源以及多向分化潜能等优势，ADMSCs在再生医学和组织工程领域备受关注。
提取脂肪间充质干细胞的方法有多种，常用的包括机械消化法、酶消化法以及分离培养法。
本文将对这些方法进行介绍和比较。
1. 机械消化法机械消化法是一种较为简单直接的提取脂肪间充质干细胞的方法。
首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。
然后，使用机械切割或研磨的方法将脂肪组织分解成小块。
接下来，使用胶原酶等酶类物质对脂肪组织进行消化。
最后，通过离心等方法将脂肪间充质干细胞与其他细胞分离开来。
2. 酶消化法酶消化法是一种常用的提取脂肪间充质干细胞的方法。
首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。
然后，使用胰蛋白酶等酶类物质对脂肪组织进行消化。
消化过程中，酶能溶解脂肪细胞膜，并释放出脂肪间充质干细胞。
最后，通过离心等方法将脂肪间充质干细胞与其他细胞分离开来。
3. 分离培养法分离培养法是一种较为复杂但效果较好的提取脂肪间充质干细胞的方法。
首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。
然后，将脂肪组织切成小块，并加入胶原酶等酶类物质进行消化。
消化后，将细胞悬液进行离心分离，得到含有脂肪间充质干细胞的细胞沉淀。
接下来，将细胞沉淀进行过滤和洗涤，去除其他细胞和残留酶类物质。
最后，将脂肪间充质干细胞进行培养，促进其增殖和分化。
以上提取方法各有优劣。
机械消化法操作简单，但提取效率较低，且存在细胞破损的风险；酶消化法提取效率较高，但对酶的质量和浓度要求较高，且酶消化过程可能影响细胞活力；分离培养法提取效率较高，且可以得到纯度较高的脂肪间充质干细胞，但操作复杂且耗时较长。
为了获得高质量的脂肪间充质干细胞，提取过程中的无菌操作非常重要。
脂肪干细胞的分离提取、鉴定及与脂肪颗粒的混合移植研究
脂肪干细胞的分离提取、鉴定及与脂肪颗粒的混合移植研究目的分離提取脂肪干细胞（ADSCs），对其进行成脂、成骨的鉴定，并与脂肪颗粒混合移植，观察移植后的脂肪组织的存活情况。
方法取大鼠腹股沟脂肪，磷酸盐缓冲液清洗，0.1%Ⅰ型胶原酶37℃消化1 h，离心，取沉淀，用含10%血清的DMEM培养基进行培养、传代，取第3代ADSCs用于成脂、成骨鉴定；另取第3代ADSCs用于移植，分为两组：ADSCs（密度为5×107/mL）0.9 mL+脂肪颗粒0.6 mL组、脂肪颗粒1.5 mL组，分别移植于大鼠背部两侧，共移植24只大鼠，分别于2周、1、3个月时脱颈椎处死8只大鼠，再取出背部脂肪组织。
结果大鼠ADSCs成脂、成骨诱导后，经油红O、茜素红染色呈阳性，移植2周、1个月时，两组取出的脂肪组织的体积变化不大；但移植3个月后，取背部脂肪组织，称重：脂肪颗粒1.5 mL组平均重量为（0.4551±0.0024）g，而ADSCs （密度为5×107/mL）0.9 mL+脂肪颗粒0.6 mL组的平均重量为（0.7798±0.0033）g，两组脂肪组织的重量差异有统计学意义（P < 0.05）。
结论原代分离、培养的ADSCs生长状况良好，具有向成脂、成骨分化的能力，与脂肪颗粒混合移植后组织的存活率高，并能够改善脂肪颗粒单独移植时的液化吸收情况。
[Abstract] Objective To isolate and culture the rat adipose-derived stem cells （ADSCs）and to identificate its multipotent differentiation ability and to observe the survival of transplantation of ADSCs with adipose compared with adipose in the back of the rats. Methods Adipose tissue were obtained from inguinal region and washed in PBS，then digested with 0.1% collagenase type Ⅰat 37℃for 1 h followed by centrifugation and ADSCs pellet was resuspended in DMEM with 10% fetal bovine serum （FBS）and seeded in flasks，cells at passages 3 were used for adipogenic differentiation and osteogenic differentiation，both sides of twenty-four rats were received subcutaneously 5×107/mL ADSCs resuspended in 0.9 mL of DMEM medium+0.6 mL of adipose and 1.5 mL of adipose，took out the adipose tissue of eight rats after two weeks，one month and three months respectively. Results ADSCs stained positively for oil red-O and alizarin red，two weeks and one month later，the weight of adipose had no difference with each other，however，after three months，the average weight of 1.5 mL of adipose group and the 5×107/mL ADSCs resuspended in 0.9 mL of DMEM medium+0.6 mL of adipose group were （0.4551±0.0024）g and （0.7798±0.0033）g respectively，thus，there were significant differences between the two groups （P < 0.05）. Conclusion ADSCs is in good condition and has adipogenic and osteogenic differentiation ability，ADSCs with adipose can improve the survival and the liquefied of the adipose after transplantation when compared with adipose alone.[Key words] Adipose-derived stem cells；Adipogenic induction；Osteogenic induction；Transplantation 脂肪组织的获得快捷、方便，2001年，Zuk等[1]从脂肪组织中分离到了一种具有多向分化能力的干细胞，即脂肪来源干细胞（ADSCs），有分化为脂肪、成骨、软骨、成肌等能力[2-3]，能够在体外稳定增殖，衰亡率低，少量的组织就可获得大量干细胞，适合大规模培养，是近年来的研究热点之一。
成人脂肪间质干细胞的复苏和培养
成人脂肪间质干细胞的复苏和培养脂肪间充质干细胞是一种能分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的多能干细胞。
因其具有强大的增殖能力和免疫调节功能，故被广泛应用于组织工程，细胞治疗和基因治疗。
成人脂肪间质干细胞取自健康成人(18至45岁)抽脂手术所得脂肪组织，拥有强大的自我更新能力并具有多向分化潜能。
取自健康成人(18至45岁)抽脂手术所得脂肪组织，用成人脂肪间质干细胞完全培养基贴壁培养，传代扩增至第二代冻存，每支含细胞1×106个。
成人脂肪间质干细胞的复苏和培养1. 准备好37℃水浴。
2. 准备好成人脂肪间质干细胞完全培养基，温育到37℃。
3. 在15 mL离心管中加入9 mL完全培养基。
4. 从液氮中取出冻存的脂肪间质干细胞，立即放入-80℃冰箱（目的是让进入冻存管的液氮稍加挥发）。
5. 在-80℃放置2-3 min后，取出冻存细胞，将冻存管迅速放入37℃温水中，快速晃动使管中内含物尽快融化。
仔细观察，待冻存管内含物完全融化后取出。
注意：•尽可能避免水没过管帽，以减少污染的风险。
•要快速完成细胞复苏过程，融化过程时间过长，会造成复苏后的细胞活性较差。
6. 用70%-75%的酒精消毒冻存管口的外壁。
7. 在超净台中打开冻存管，用吸管将细胞冻存悬液移入装有完全培养基的离心管中。
注意尽量避免产生气泡。
8. 为了减少细胞损失，往冻存管中加入1 mL完全培养基，稍微吹打，用吸管将这1mL的细胞悬液吸入离心管中，再用吸管将离心管中的细胞轻轻吹打混匀。
9. 将细胞悬液经250 g（对应于Eppendorf 5810R离心机是1134 rpm）离心5 min。
10. 尽量去除上清液，向细胞沉淀物加入1-2 mL的完全培养基（已预热到37℃），轻轻吹打均匀。
11. 将细胞全部接种到1个T25培养瓶或底面积相当的培养器皿中，加入足量的完全培养基。
轻轻摇晃细胞培养器皿，使细胞均匀分布。
12. 放入37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。
脂肪细胞培养方法
脂肪细胞培养方法
脂肪细胞培养方法是脂肪生物学研究中常用的一种技术，其目的是在体外培养脂肪细胞，用于研究脂肪细胞的生理功能、疾病发生机制以及药物筛选等方面。
以下是脂肪细胞培养方法的一般步骤：
1. 预处理：将脂肪组织从体内取出，经过清洗、离心等处理，制成脂肪组织细胞悬浮液。
2. 细胞分离：使用酶消化法或机械剪切法将脂肪组织细胞从脂肪组织中分离出来。
3. 细胞培养：将分离出的脂肪细胞接种到培养皿中，加入含有生长因子、抗生素等营养成分的培养基，进行细胞培养。
4. 细胞鉴定：使用显微镜观察细胞形态，使用细胞计数法、流式细胞术等方法对细胞进行鉴定。
5. 细胞功能研究：对培养的脂肪细胞进行功能实验，如脂质代谢、细胞增殖、细胞分化等。
6. 细胞保存：将培养好的脂肪细胞冻存于液氮中，以备后续实验使用。
需要注意的是，脂肪细胞培养过程中可能会出现细胞死亡、细胞污染等问题，因此需要严格控制实验条件和操作步骤，以保证细胞培养的效率和质量。
脂肪干细胞的分离培养、分化及其应用
脂肪干细胞的分离培养、分化及其应用摘要：脂肪干细胞（ADSCs）属于间充质干细胞，可以从脂肪组织中分离获得，具有多向分化能力，在不同诱导液诱导下，能够分化为多种细胞，应用于临床治疗中。
本文结合以往学者研究，针对ADSCs分离、分化以及应用展开研究。
关键词：脂肪干细胞；分离培养；细胞分化；易学应用前言：ADSCs是通过脂肪组织提取的MSCs，如今技术研究逐渐深入，分离提取ADSCs的方法逐渐完善。
目前常见酶消化法、胶原酶、机械分离以及悬浮培养法等多种方法，提取ADSCs需要关注试剂、冻存试剂、离心转速以及传代代数等多个方面。
凭借其分化优势，在临床研究中受到了极大关注。
1 ADSCs的分离培养提取ADSCs的方法有多种，但目前广泛使用吸脂术提取脂肪，在无菌环境中制作脂肪粒，将血管以及结缔组织剔除后，进行包膜。
使用Ⅰ型胶原酶在恒温环境中消化处理1h。
停止消化后，设定1800r/min离心速度，获取基质血管成分，使用过筛网过滤至培养皿中进行培养。
经过换液传代后，可以获得ADSCs样本。
冻存液配比1:4:5的DMSO：含胎牛血清培养液：胎牛血清，使用程序降温法冻存，保存温度为-80℃最好[1]。
2 ADSCs的分化ADSCs分化能力强大，在不同环境中，能够分化为不同胚层源细胞，分别为内胚层、中胚层以及外胚层。
2.1 内胚层第一，分化为肝细胞样细胞，通过无血清培养ADSCs后，使用HGF、烟酰胺以及bFGF 继续培养2周，可以促进ADSCs诱导为肝细胞样细胞。
使用HGF、FBS、FGF配置诱导液，经过3周诱导后，能够检测出肝细胞标志物，证明能够诱导为肝细胞样细胞。
第二，分化为胰岛细胞。
有学者使用烟酰胺、激活素、HGF等配置诱导液，进行ADSCs培养，经过15d诱导，可检测到胰岛素基因蛋白以及促进因子，证明成功诱导分化为胰岛样细胞[2]。
2.2 中胚层首先分化为心肌细胞，有研究指出，在氮杂胞苷的诱导下，可推动ADSCs分化为心肌细胞，由于氮杂胞苷也存在一定毒性，需要寻找有效试剂取代氮杂胞苷。
干细胞分离培养步骤
家兔BMSC分离培养步骤1.麻醉、备皮、消毒、铺巾：取1只4-5周龄新西兰幼兔，速眠新肌肉注射(0．1～0．2mL／kg)麻醉。
仰卧固定于操作台上，褪毛，备皮，2%碘酒、75%酒精（或碘伏）常规消毒，铺洞巾(洞巾孔洞应控制在lcm左右，以利于减少污染)。
2. 在双侧踝关节处环形剪开皮肤，再纵行剪开皮肤至骶尾部，分离肌肉、筋膜等软组织至见骨膜，电锯离断踝关节、膝关节及髋关节，获取家兔股骨和胫骨（桡骨）,置于装有PBS液的无菌盒内。
（亦可从髂前上棘穿刺抽取骨髓）3．用PBS液体清洗骨组织3-4遍，去除杂物、血迹后，在超净工作台上，无菌条件下剥离骨周围的肌肉软组织，用眼科剪从股骨和胫骨的干骺端打开骨髓腔，用含有适量肝素( 625 U/mL)的DMEM 液冲洗骨髓腔，收集冲洗液约 6 ～ 8 mL。
吸管反复吹打后，1 500 r/min，离心5 min，弃上清。
加入 DMEM 培养基重悬，将上述细胞重悬液按照1∶ 1 的比例缓慢滴加到密度为 1. 073 g/mL 的PercoⅡ分离液中，1 500 r / min 离心 20 min。
离心后管内容物分为 3 层，收集中间乳白色云雾状的单个核细胞层，加入 DMEM 培养液稀释混匀，1 500 r/min 离心 5 min，洗涤 2 ～ 3 次，去除多余的脂肪细胞及组织液。
用含双抗的 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培养基重悬细胞，以 2. 0 × 10^5个/cm2的细胞密度接种于25cm^2培养瓶中，置于37 ℃，5%、饱和湿度的孵箱中培养。
4. 48小时后首次半量换液，去除浮物及其它非贴壁细胞（如造血干细胞），后每隔3天换液一次。
5. 7-10天后，待细胞融合长满至80%以上时用0.25%胰蛋白酶消化传代。
经过第一次传代后，骨髓间充质干细胞大约能占60%左右，并且呈漩涡状生长；一般经过3次左右传代后，骨髓间充质干细胞大约能占90%左右。
脂肪干细胞的分离培养及向神经元诱导过程中肌动蛋白的表达的开题报告
脂肪干细胞的分离培养及向神经元诱导过程中肌动蛋白的表达的开题报告一、研究背景脂肪干细胞是一种来源广泛、取材方便的干细胞，具有自我更新能力和多向分化潜能。
在实验和临床研究中，脂肪干细胞已被广泛应用于组织工程、再生医学及干细胞治疗等领域。
近年来，越来越多的研究表明，脂肪干细胞具有向神经元分化的潜能，可用于神经退行性疾病的治疗。
肌动蛋白是一种肌肉细胞特异性蛋白，参与肌肉收缩及细胞运动等生物学过程，也是一个明显的标记神经元分化的分子。
因此，研究脂肪干细胞向神经元分化过程中肌动蛋白的表达变化，有助于深入了解脂肪干细胞向神经元分化的分子机制，为其应用于神经退行性疾病的治疗提供理论依据。
二、研究目的通过分离培养人体脂肪干细胞并向神经元诱导分化的方法，观察肌动蛋白的表达变化，探讨脂肪干细胞向神经元分化的分子机制，为其应用于神经退行性疾病的治疗提供理论基础。
三、研究内容与方法1. 分离人体脂肪干细胞：从腹部、臀部等部位获得人体脂肪组织，采用酶消化法及离心等方法进行脂肪干细胞的分离纯化，流式细胞术及倒置显微镜观察细胞形态，检测ALP酶活性，验证干细胞的存在。
2. 向神经元诱导分化：将脂肪干细胞培养于神经元诱导培养基中，观察细胞形态的变化，利用神经元特异性标记物TUJ1、NF、NFM等检测细胞的神经元特异性表达，探讨神经元诱导分化的效率。
3. 肌动蛋白的表达变化观察：利用Western blot或免疫荧光等技术检测肌动蛋白在向神经元分化过程中的表达量变化，分析肌动蛋白在脂肪干细胞向神经元分化中的作用与分子机制。
四、预期结果及意义通过以上方法，我们可以分离培养人体脂肪干细胞，成功地向神经元诱导分化，并探讨肌动蛋白在脂肪干细胞向神经元分化中的表达变化，从而深入了解脂肪干细胞向神经元分化的分子机制，为其应用于神经退行性疾病的治疗提供理论依据。
脂肪干细胞
脂肪干细胞脂肪干细胞第一节脂肪干细胞的生物特性2001年，Zuk等首次从人抽脂术抽取的脂肪组织中分理处一种多向分化干细胞，因其与骨髓间充质干细胞（BMSC）形态相似而称为脂肪间充质干细胞（ASC）。
此后几个研究小组也先后采用相似的分离方法分别从脂肪组织中分离得到ASCE。
近年来许多研究表明，脂肪干细胞具有向脂肪、骨、软骨、肌肉、内皮、造血、肝、胰岛和神经等多种细胞方向分化的多分化潜能，是一种理想的种子细胞。
因脂肪干细胞具有分化为脂肪的潜能，且其具有易获得性、可迅速扩增、不衰老等特点，目前脂肪干细胞已经成为脂肪组织工程中组织细胞的研究热点。
1. 脂肪干细胞的分离、培养脂肪干细胞在脂肪组织中含量很低，要利用脂肪干细胞就必须进行体外分离培养扩增。
常用的方法是将剪碎的脂肪组织消化离心，倾去上层脂肪及上清，获得基质血管层，将其收集到培养瓶中培养，除去未贴壁的红细胞和残渣，剩余的细胞群体称为加工过的脂肪吸取物。
原代培养的细胞中贴壁的细胞较少，细胞生长至融合后传代，传代后的细胞称为脂肪干细胞。
平均每300mL脂肪组织可获得2×10~6×10个这样的细胞。
体外培养条件下，ASC的培养不像BMSC对培养基中胎牛血清的来源和质量有严格要求，DMEM、aMEN、RPMI1640是ASC 的常用培养基。
一般只添加体积分数为10%的胎牛血清，并且血清无生产批号限制。
在传代培养中，平均倍增时间为60h。
并表现低水平衰老，1代时细胞没有出现衰老现象，10代时少于5%细胞出现衰老，15代时衰老细胞比例仍低于15%，这表明脂肪ASC体外扩增能力很强，传代培养易于获得大量有分化能力的细胞。
2.脂肪干细胞的鉴定Zuk等认为，ASC可能由多种异源性细胞构成，其中包括内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞以及前体脂肪细胞等。
但部分学者采用流式细胞仪和间接免疫荧光等方法，分别以因子Ⅷ、平滑肌蛋白、ASC的特异单克隆抗体鉴定ASC中是否存在内皮细胞、平滑肌细胞以及成纤维细胞，结果发现前两种单克隆抗体抗阳性染色的细胞比例较少，绝大多数ASC单克隆抗体阳性染色的细胞，提示ASC主要由成纤维细胞以及来自间叶组织的细胞构成，仅伴有少量内皮细胞与平滑肌细胞。
人体脂肪干细胞培养及成骨诱导分化
人体脂肪干细胞培养及成骨诱导分化人体脂肪干细胞培养及成骨诱导分化引言干细胞是一类具有自我更新和多能性的细胞，可以不断分化生成各种不同类型的细胞。
人体脂肪组织中存在一种特殊类型的干细胞，即人体脂肪干细胞（human adipose-derived stem cells，hADSCs）。
与其他干细胞相比，hADSCs具有较高的抽取和培养效率，而且可以从自身脂肪组织中获得，不需要侵入性手术。
因此，hADSCs成为研究人体再生医学和组织工程领域的热门课题之一。
本文将介绍人体脂肪干细胞的培养方法以及成骨诱导分化的研究进展。
人体脂肪干细胞培养1. 来源和提取人体脂肪组织富含脂肪干细胞，因此从脂肪组织中提取hADSCs是最常用的方式之一。
提取过程通常通过脂肪抽吸或手术操作完成。
在脂肪抽吸中，通过低压吸引脂肪组织，并用特殊工具将其收集。
手术操作则需要进行小切口，直接收集脂肪组织。
提取得到的脂肪组织需要经过一系列处理，如洗涤、消化、离心等，以获得单个细胞悬浮液。
2. 培养条件提取得到的hADSCs需要在适宜的培养条件下进行扩增。
通常，使用营养丰富的培养基，如DMEM/F12，加入适量的胎牛血清和抗生素，以提供必需的生长因子和营养物质。
细胞培养的环境需要保持在37℃，5% CO2的恒温恒湿条件下。
培养过程中，需要定期更换培养基以保持细胞的生长和代谢活性。
3. 鉴定和鉴定为了确认提取得到的细胞为hADSCs，需要进行鉴定和鉴定。
常用的方法包括油红O染色、免疫细胞化学染色和流式细胞术分析。
油红O染色可用于检测细胞中脂滴的积累情况，免疫细胞化学染色可检测特定表面标记物的表达水平，流式细胞术则可对细胞表型进行全面的分析。
人体脂肪干细胞成骨诱导分化人体脂肪干细胞具有向多个细胞系分化的潜力，其中包括成骨细胞。
为了将hADSCs诱导分化为成骨细胞，需要在体外提供特定的诱导因子。
1. 前处理在进行成骨诱导前，需要对hADSCs进行适当的前处理。
人脂肪间充质干细胞的分离、培养及鉴定
ｕ ｄ ｒ ｎ ｌ ｃｉ ｅ ｌ ｏ ｕ ｔ ｎ ｎ ｅ ｗｅ ｔｅｅ ｔ ｉ ｓ ｃ ｉ ．Ｗ ｅ ｄ ｔ ｃ ｅ ｈ ｒ ｌ ｅ ａ ｉ ｎ ｃ ｐ ｃｔ ｆｔ ｅＡＤＳ ，ａ ｄ ｔ ｅ ｎ ｌ ｚ ｄ ＡＤＳ ｖ ｐ ｏ ｅｅ ｔｄｔ ｅｐ ｏｉ ｒｔ ａ ａ ｉ ｏ ｈ ｆ ｏ ｙ Ｃｓ ｎ ｈ ｎ ａ ａ ｙ ｅ Ｃｓ ｓ ｒａ ｅ ｍａ ｋ ｒ ｒ ｆｌ ｙ ｆ ｗ ｙ ｏ ｔ ｙ Ｔｈ ｘ ｒ ｓ ｉｎ ｌｖ ｌ ｆ ｔａ ｓ ｒｐ ｉｎ ｆ ｃ ｏ ｓ ｗｅ ｅ ｄ ｔ ｃ ｅ ｙ ＲＴ ｕ ｆ ｃ ｒ ｅ ｓｐ ｏ ｉ ｂ ｌ ｃ ｔ ｍｅ ｒ ． ｅ ｏ ｅ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｅ ｅ ｓ ｏ ｒ ｎ ｃ ｉ ｔ ａ ｔ ｒ ｒ ｅ ｅ ｔｄ ｂ ｏ
脂肪 间充 质干细胞 （ｄｐ ｓ—ｅｉ ｄｓｒｍａ ｃｌ ，ＡＤ Ｃ ）是 一 类存 在 于脂 肪 基 质 的具 有 多 向 ａ ｉｏｅｄ ｒ ｅ ｔ ｖ ｏ ｌ ｅｓ ｌ Ｓ ｓ 分化 潜 能的成体 干 细 胞． －］ 肪 间充 质 干 细 胞 相 对 于 目前应 用 较 多 的骨 髓 间 充 质 干 细胞 （ ＭＳ ２脂 Ｂ Ｃ）
来说 ，具有 来 源丰富 、容 易获得这 一独 特优点 ．３因此 ，为 确 定其 是 否 适 合细 胞 治疗 ，需 要 对 ＡＤＳ ［ Ｃ 进行 生物学 性质 及其体 外 增殖 能 力 和 干 细胞 特 性 的鉴 定 ．本 研 究 对 来源 于 脂 肪 吸脂 术 分 离 的 ＡＤＳ Ｃ
小鼠附睾脂肪干细胞的分离培养及鉴定
小鼠附睾脂肪干细胞的分离培养及鉴定张鉴清1，季佳霖2，崔新明2，张祺3，李艳茹21吉林大学第四医院，吉林省长春市130011；2吉林大学病理生物学教育部重点实验室，吉林大学基础医学院病理学系，吉林省长春市130021；3吉林大学，吉林省长春市130021 Isolation, culture and identification of adipose-derived stem cells from mouse epididymisZhang Jian-qing1, Ji Jia-lin2, Cui Xin-ming2, Zhang Qi3, Li Yan-ru21 the Fourth Hospital of Jilin University, Changchun 130011, Jilin Province, China;2 the Key Laboratory of Pathobiology of Ministry of Education, Department of Pathology, School of Basic Medical Sciences, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China;3 Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China 摘要背景：脂肪干细胞作为一种新的成体干细胞，具有来源丰富、取材容易、增殖能力强等优点，受到人们越来越多地关注。
目的：体外分离培养小鼠附睾脂肪组织中的脂肪干细胞，并鉴定其生物学特性。
方法：无菌切取小鼠附睾处脂肪组织，采用胶原酶进行消化，利用1次消化多次收集与差速贴壁法分离纯化脂肪干细胞。
倒置显微镜及透射电子显微镜观察脂肪干细胞的形态。
绘制脂肪干细胞的生长曲线。
流式细胞术检测脂肪干细胞的免疫表型。
加入细胞诱导剂对脂肪干细胞进行成骨及成脂肪的诱导分化。
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脂肪干细胞分离培养
1. 向脂肪组织加入等体积2*P/S的PBS，充分混匀，彻底移除上清，
上述步骤重复2次；
2. 用DMEM培养基（不含血清）把胶原酶I(collagenase I)储液稀释
至0.01%（工作液浓度），把上述洗涤后的脂肪组织转移至新的50ml
离心管，加入脂肪组织体积5倍的胶原酶I工作液浓度，用小剪刀把
脂肪组织剪碎，用封口膜封口后，把置于37℃水浴锅中, 孵育30min，
每隔5 min弹匀一次；
3.加入消化液等体积的完全培养基（DMEM, 10%FBS，1*P/S）终止
胶原酶消化，离心（1200g, 10min）沉淀细胞；
4. 加入10倍细胞沉淀体积的完全培养基重悬沉淀，用孔径100um的
尼龙膜细胞筛滤掉组织块；
5. 把细胞接种于10cm的培养皿中（接种密度为30-50%），加入完全
培养基至总体积为10ml；
6. 24h后，进行换液以移除未贴壁的细胞；
7．每隔2-3天进行半量换液，待细胞长满至密度为80-90%时进行传
代；
8. 第一次传代后的细胞为P1代细胞，P1代细胞长满至密度为80-90%
时进行冻存；
9. 传代，保种，拍照：每代（P0，P1，P2，P3）均需拍照；每代（P0，
P1，P2，P3）均需保种，一半保种，一般传代。