人脂肪干细胞的分离培养及鉴定

。
．
图 ３ 脂 肪 干 细胞 的表 型 特 征
被 称 为 Ａ Ｓ ｓ的 细 胞 ， 具 有 一 般 干 细 ＤＣ 它 胞 的 特性 ， 骨 髓 干 细 胞 相 比 ， 具 有 明 与 它 显优 势 ， 来 源 、 材 、 增 能 力 方 面 ， 在 取 扩 都
是骨 髓 干 细 胞 所 无 法 比拟 的 ， 可作 为 种 子
到第 １ ４天 时 可 见 细 胞 铺 满 瓶 底 ８ ％ 左 ０
右 。 而传 代 细 胞 生 长 速 度 明 显 快 于 原 代
陶凯 等 通 过 不 同 血 清 浓 度 作 用 下 生 长 曲线 绘 制 发 现 ， 血 清 浓 度 为 １％ 在 ５ 和 ２ ％ 时 ， 最 短 时 间 内 细 胞 可 进 入 平 ０ 在 台期 ， 到 细 胞 增 殖 高 峰 期 ， 合 考 虑 性 达 综 价 因 素 ， 际 应 用 中 可 将 １％ 作 为 血 清 实 ５ 的最 适 宜 浓 度 。通 过 两代 生 长 曲线 发 现 ， 第 ２代 细 胞 较 原 代 细 胞 更 快 进 入 增 殖 高
摘
要 目的 ： 索从 健 康 成人 脂肪 组 织 探 中分 离 、 养 并 鉴 定 脂 肪 千 细胞 。 方 法 ： 培
用健 康 成 人 的 脂肪 组 织 ， 除 可 见 纤 维结 剔
１ ， 次 当贴 壁细 胞接 近融 合时再 次传 代。
光学 显 微 镜 下 观察 细胞 生 长 及 形 态 。 流 式 细 胞 仪检 测 相 关 抗 原 ： 流式 细 胞 仪对 第 ３代 脂 肪 干 细 胞 表 面 相 对 特 异 性
２ 王红祥 ， 李宾公 ， 邵诗颖 ， 人脂肪组 织分 等． 离培养基 质 干细胞 的方 法及 其 表型 鉴定 ［ ］ 中国临床康复，０ ６，０ ４ ） １ Ｊ． ２０ １ （ １ ：６—１ ． ８
３ 陶 凯 ， 晓燕 ， 久 龙 ， ． 脂 肪 组 织 来 源 刘 梁 等 人
脂 肪 干 细 胞 的 鉴 定 ， 无 直 接 的 方 尚
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人 脂 肪 干 细 胞 的 分 离 培 养 及 鉴 定
孙 庆 章 ４ ３０ ７ ００河南 省 南 阳 市 医 专 第 一 附属
医院 科 教 科
５ 、 和 湿 度 的培 养 箱 中孵 育 ， 后 首 ％ 饱 ５天 次换 液 ， 后 ３天 换 液 １ ， 原 代 细 胞 之 次 待 达 ８ ％ 融 合 时 消 化 传代 。 ５ 脂 肪 干 细 胞 的传 代 培 养 ： 原代 培 养 细 胞达 到 ８ ％ 融 合 时 ， ０２ ％ 胰 蛋 白酶 ５ 以 ．５ 将 贴 壁细 胞 消 化 分 离 ３～５分 钟 ， ： １ ２进
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的仍是一种混合细胞 ， 其中混杂有部分前 体细胞 ， 如何 纯 化 及 怎 样 示 踪 和标 记 脂 肪 干细 胞 ， 该 领 域 亟 需 解 决 的 问题 。 是
鼹黧 鞘
圈 １＝原 代 培 养 ７ ｘ４ 圈２＝第 ３ 细 胞 培 彝 ６ ×４ 天 ０ 代 天 ０
法 。一 般 通 过 培 养 过 程 中 出现 的 分 化 表
干细胞体外培养条件的优化 ［ ］ 中国美容 Ｊ． 整 形外 科 杂 志 ，０ ７ ｌ（ ）２ ３—２６ ２ ０ ，８ ３ ：２ ２．
中国社 区 医师 ・ 医学专业 ２ １ 年第 ０ ０１ ８期 （ ３ 总 第２９ 第１ 卷 ６ 期
脂 肪 干 细胞 的表 型特 征 ： 流式 细 胞 仪
分 析 第 ３代 的 脂 肪 干 细 胞 的 细 胞 表 型 ，
参 考 文 献
１ 付 柏林 ， 力 ． 肪 干 细 胞 在 表 皮 组 织 工 程 郭 脂
眼科 剪 剔 除 脂 肪 组织 中可 见 血 管 ， 碎 至 剪 细小 颗 粒 ，． ％ Ｉ型 胶 原 蛋 白 酶 消 化 ， ０１ １０ ｒ分 离 心 １ 钟 ， 除 脂 肪 细 胞 及 ５ ０／ ０分 去 上清液 ， Ｄ—ｈｎ ｓ 重 悬 沉 淀 ，０ 目细 ａｋ 液 ２０ 胞 筛 过 滤 ，５Ｏ／ 离 心 １ 钟 ， 得 细 １０ ｒ分 ０分 所 胞 提 取 物 用 含 １ ％ 胎 牛 血 清 的 高 糖 ５ Ｄ Ｅ 培养 液 重 悬 ， Ｍ Ｍ 以适 当密 度 接 种 于 无 菌 培 养 瓶 中 ， ３ ＇ Ｃ ，体 积 分 数 为 在 ７Ｕ、 Ｏ
肪 干 细胞 。
Ｃ４ Ｄ ４荧 光 抗 体 ，Ｅ — Ｄ ９荧 光 抗 体 ， Ｐ Ｃ２
Ａ Ｃ—Ｃ １５荧 光 抗 体பைடு நூலகம்各 ２ ，℃ 孵 育 Ｐ Ｄ０ ０ ｌ４ ３ ０分 钟 ， 用 Ｐ Ｓ缓 冲 液 清 洗 ２遍 ， 后 再 Ｂ 最
用 １％ 福 尔 马 林 固 定 细 胞 ， 机 测 定 抗 ０ 上 原 的 阳性 率 。
胰 蛋 白酶 ， 湿 培 养 箱 ， 置 显 微镜 ， 胞 恒 倒 细 计数仪 ， 流式 细 胞 仪 ， 速 水 平 离心 机 ， 低 超
净 工作 台 ，Ｄ ９ Ｃ ４ 、 Ｄ ０ 。 Ｃ ２ 、Ｄ ４ Ｃ １５ 脂 肪组 织 来 源 ： 验 所 用 成 人脂 肪 组 实 织 来 自蚌 埠 医 学 院第 一 附 属 医 院 抽 脂 术 的健 康 女性 ， 年龄 ２ ４ ５～ ５岁 。 脂肪 干 细 胞 的 原 代培 养 ： 菌条 件 下 无 提 取 脂肪 组 织 约 １ ｇＰ Ｓ液 洗 去红 细胞 。 ５ ，Ｂ
６
中的研究进展 ［ ］ 泸州 医学院学报 ，０ ９ Ｊ． ２０ ，
３ （ ）８ ２ １ ：０—８ ． ２
Ｃ２ Ｄ ９阳 性 率 为 ８ ％ ±２ ， Ｄ ４阳 性 率 ６ ％ Ｃ４
为 ９ ％ ±１ ， Ｄ ０ 阳 性 率 为 ７ ％ ± ３ ％ Ｃ １５ ８
２ 。见 图 ３。 ％
讨 论
结 果
．
关键词
定
脂 肪 干 细 胞 分 离 培 养
鉴
体 外 实验
ｄ ｉ １ ． ９ ９ ｊ ｉ ｎ １ ０ —６ ４ ． ０ ｏ ： ０ ３ ６ ／． ｓ ． ０ ７ ｓ １ｘ ２ １． １
Ｏ８．ｍ４ （
脂 肪 千细 胞 的 形 态 ： 有 脂 肪 干 细 胞 将 组 织 工程 的一 个 研 究重 点 ， 是种 子 细 胞 的 来 源 。研 究 发 现 脂 肪 组 织 含 有 一 种 贴 壁 的 培养 瓶 口旋 紧 ， 平 放 置 在 倒 置 显 水
—
一
．
肪 干 细胞 ， 外 环 境 扩 增 传 代 ， 式 细 胞 体 流
仪 检 测 细 胞 表 面 高度 表 达 Ｃ ２ ， Ｄ ４ Ｄ９ Ｃ ４ ， Ｃ １５等 ， 有 间 充 质 干 细 胞 特 性 。 结 Ｄ０ 具
论 ： 以从 人 脂 肪 组 织 中分 离 、 养 出脂 可 培
材料 与方 法 试剂与仪器 ： 低糖 Ｄ Ｅ 培 养 液 ，Ｉ Ｍ Ｍ
型胶 原 酶 ， 牛血 清 ， Ｂ 胎 Ｐ Ｓ缓 冲液 ， ． ５ ０２％
细胞 。传 代 后 细 胞 增 殖 明显 加 快 ， 第 ３ 于 天 开 始数 量 明 显 增 多 ， ５～６天 后 细 胞 即 已长 满 培 养 瓶 底 ， 胞 排 列 更 加 整 齐 有 细
缔组 织后 剪 碎 ， 原 酶 法 分 离 并体 外 培 养 胶 脂肪 干 细胞 ， 进 行 流 式 细 胞 术 鉴 定 。结 并
果 ： 以从 健 康 成 人 脂 肪 组 织 中提 取 出脂 可
抗 原 进 行 检 测 。０ ２ ％ 胰 蛋 白 酶 消 化 待 ．５
检细 胞 ，５ ０／ 离 心 １ １０ ｒ分 Ｏ分 钟 ， 细 胞 沉 在 淀中（ 细胞 数 量 约 １ ０ ） 别加 入 ＦＴ １ 分 ｘ ＩＣ
细胞 应 用 于 组 织 工 程 。
微镜下观察 ， 原 代细胞 培养 ２ 在 ４小 时 后 可 见少量 较 大 的 呈 梭 形 的脂 肪 干 细 胞 贴 擘 ， 首 次换 液 ， 胞 清 晰 可 见 ， 多 角 ４天 细 呈 形 、 锤 形 ， 落 样 生 长 ９天 后 细 胞 生 纺 集 长 明 显增 加 ， 涡旋 状 生 长 。从 原代 培 养 呈
序 ， 质 细胞 极 少 见 。见 图 １２ 杂 、。
峰， 即细胞在最初传代后 ， 生长加快 ， 与实 际培养 中所见 的适度传 代促进增 殖相一 致 。笔者在实验过 程 中也得 到 了相似 的
结 论 。需 要 强 调 的 是 ， 究 中采 用 的虽 是 研 公 认 的分 离 培 养 流 程 ， 实 际操 作 中得 到 但
行传 代 ， 接种 于 ２ ｍ 培 养 瓶 中 ， ５ｌ ３天 换 液
型 逆 推 得 知 。研 究 证 实 多 种 干 细 胞 皆 可
表 达 ｃ ４ ， 免 疫 组 织 化 学 方 法 检 测 细 Ｄ４用 胞 Ｃ ４ 阳 性 表 达 ， 明 细 胞 源 自干 细 Ｄ４ 表 胞 。免 疫 荧 光 和 流 式 细 胞 术 检 测 显 示 ， Ｄ ９ Ｃ ４ 、 Ｄ ０ 、 Ｄ ３是 间 充 质 Ｃ ２ 、 Ｄ ４ Ｃ １５ Ｃ １ 干 细 胞 的 特 征 性 表 面 标 志 。 它 们 在 脂 肪 干 细 胞 中 阳 性 表 达 说 明 脂 肪 干 细 胞 具 有 间充 质 干 细胞 表 型 。