DNA复制 PPT课件
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第三十三章 DNA复制
提纲
一．
二．
三．
DNA复制的一般特征 参与DNA复制的主要酶和蛋白质 DNA复制的详细机制
1. 以大肠杆菌为代表的细菌基因组DNA的 “θ-复制” 系统 2. “滚环复制”系统 3. D-环复制系统 4. 真核细胞的细胞核DNA复制 5. 古菌的DNA复制
四．
五．
DNA复制的高度忠实性 DNA复制的调节机制
ຫໍສະໝຸດ Baidu 复制叉的结构
电镜下真核生物DNA的多个复制叉结构
John Cairns的实验
复制开始时，将大肠杆菌放在含低剂量的[3H]-dT的 培养基中培养几分钟；随后，将细菌转移到含高剂 量的[3H]-dT的培养基中继续培养一段时间；最后， 收集细胞，小心地裂解以抽取其中的染色体DNA进 行放射自显影。如果是单向复制，自显影图谱上银 颗粒的密度应该是一端高、一端低；如果是双向复 制，则应该中间是一段低密度的银颗粒，两侧是高 密度的银颗粒。低密度银颗粒意味着这一段DNA属 于复制起始区，高密度颗粒代表的是后来合成的。
细菌DNA 聚合酶—— DNA pol I,II,III,IV和V 真核生物DNA 聚合酶—— DNA pol α,β,γ,δ和ε以
及更多
Arthur Kornberg (1957)
大肠杆菌细胞蛋白质提取物 + DNA模板 有无DNA合成?? - dNTPs - Mg2+ (辅助因子) - ATP (能源) - 游离的3’OH端 (引物) 体外测定DNA复制
Okazaki的脉冲标记和脉冲追踪的实验结果分析
在复制叉中不连续合成的DNA片段称为冈崎片 段，连续合成的DNA子链被称为前导链，不连 续合成的DNA子链被称为后随链或滞后链。
参与DNA复制的主要酶 和蛋白质的结构与功能
① ② ③ ④ ⑤
⑥
⑦
DNA聚合酶 DNA解链酶 单链结合蛋白 DNA引发酶 DNA拓扑异构酶 DNA连接酶 端聚酶（真核生物特有）
DNA聚合酶
DNA聚合酶的全名是依赖于DNA的DNA 聚合酶，就是以DNA为模板，催化DNA 合成的聚合酶。 DNA聚合酶是参与DNA复制的主要酶， 该酶的许多性质直接决定了DNA复制的 一些基本特征。
DNA聚合酶
反应通式：
Mg2+ DNA + 引物-OH + dNTP DNA/引物-dNMP + PPi 5′ 3′ 随后的 PPi迅速水解驱动反应的进行
DNA复制的一般特征
① ② ③ ④
⑤
⑥ ⑦
⑧
⑨
以原来的DNA两条链作为模板，四种dNTP 为前体，还需要Mg2＋ 作为模板的DNA需要解链 半保留复制 需要引物——主要是RNA，少数是蛋白质 复制的方向始终是5′→3′ 具有固定的起点 多为双向复制，少数为单向复制 半不连续性 具有高度的忠实性和进行性
目前是Standford大 学医学院的终身教授
纯化得到DNA聚合酶I
DNA聚合酶I
一条肽链至少具有三种不同的酶活性！ 不可思议!!! 5′→3′外切核酸酶 3′→5′外切核酸酶 5′→3′DNA聚合酶
DNA聚合酶折叠成几个不同的结构域
Hans Klenow 使用枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶处理 DNA聚合酶I，结果得到大小两个片段：大片段被称 为Klenow片段或Klenow酶，含有大小两个结构域， 其中小结构域具有3′→5′外切酶活性，大结构域具有 5′→3′聚合酶活性；小片段只有5′→3′外切酶活性。 Tom Steitz等得到了Klenow酶的晶体结构
DNA复制可能的三种方式
由Meselson和Stahl设计证明半保留复 制的实验被誉为生物学最美丽的实验
Meselson 和Stahl的证明DNA半保留复制的实验流程
Meselson 和Stahl的实验结果
Meselson与Stalh在42年以后在最初 他们相遇的一颗树下重逢时的合影
Taylor以蚕豆根尖细胞为材料、使用放射性同 位素证明真核细胞DNA也是半保留复制的实验。
某些生物DNA复制的引物序列
证明DNA复制的方向始终是5′→3′的末端终止实验
DNA复制起始区的特征
①
②
③
由多个短的重复序列组成； 能够被多亚基的复制起始区结合蛋白识别； 通常富含AT碱基对，这有利于DNA复制起 动时的解链，因为AT碱基对含有的氢键数目 低于GC碱基对。
细菌和酵母DNA复制起始区的特征
Cairns证明大肠杆菌DNA双向复制的实验
Reiji Okazaki的实验
脉冲标记——目的在于即时标记在特定 时段内合成的DNA。 脉冲追踪——目的则是要弄清那些被标 记上的DNA片段后来的去向。
Okazaki的脉冲标记和脉冲追踪的实验
Okazaki的脉冲标记和脉冲追踪的实验结果分析
结论：一定有其他DNA聚合酶。生化学家很 快从polA突变体纯化到新的DNA聚合酶
DNA聚合酶I的功能究竟是什么？
在多种需要短DNA合成的过程中起作用 在DNA修复中起主要作用 在DNA复制中，去除RNA引物，并填补随后留下 的空缺。
对DNA聚合酶I更多的认识
为什么具有3′→5′外切核酸酶?
Klenow酶的晶体结构模型
切口平移
DNA聚合酶I所具有的5′→3′聚合酶和5′→3′外切酶活性的联合使用可 导致一个具有切口的DNA分子发生切口平移。如果在切口平移反应 中加入放射性标记的dNTP，则放射性标记的核苷酸会参入到重新合 成的DNA链上，从而使DNA的一条链带上同位素标记。
DNA 聚合酶I是不错，然而….
1969年，John Cairns等人 分离到一种大肠杆菌突变株 其DNA聚合酶I活性只有野生型的1% (polA 基因突变) 突变体对UV辐射极为敏感 其他一切正常 细胞照常分裂 结论:
DNA聚合酶I不是大肠杆菌DNA复制的主要聚合酶
其他线索….
速度太慢 酶量太多 进行性不够高——聚合酶的进行性是指一种聚合 酶从与DNA模板结合到与模板解离的这段时间内 催化参入到DNA链上的核苷酸数目。显然，DNA 聚合酶的进行性越高，催化复制的效率就越高。 聚合酶I的进行性平均值为20nt~50nt，远远低于 DNA复制的实际值。
提纲
一．
二．
三．
DNA复制的一般特征 参与DNA复制的主要酶和蛋白质 DNA复制的详细机制
1. 以大肠杆菌为代表的细菌基因组DNA的 “θ-复制” 系统 2. “滚环复制”系统 3. D-环复制系统 4. 真核细胞的细胞核DNA复制 5. 古菌的DNA复制
四．
五．
DNA复制的高度忠实性 DNA复制的调节机制
ຫໍສະໝຸດ Baidu 复制叉的结构
电镜下真核生物DNA的多个复制叉结构
John Cairns的实验
复制开始时，将大肠杆菌放在含低剂量的[3H]-dT的 培养基中培养几分钟；随后，将细菌转移到含高剂 量的[3H]-dT的培养基中继续培养一段时间；最后， 收集细胞，小心地裂解以抽取其中的染色体DNA进 行放射自显影。如果是单向复制，自显影图谱上银 颗粒的密度应该是一端高、一端低；如果是双向复 制，则应该中间是一段低密度的银颗粒，两侧是高 密度的银颗粒。低密度银颗粒意味着这一段DNA属 于复制起始区，高密度颗粒代表的是后来合成的。
细菌DNA 聚合酶—— DNA pol I,II,III,IV和V 真核生物DNA 聚合酶—— DNA pol α,β,γ,δ和ε以
及更多
Arthur Kornberg (1957)
大肠杆菌细胞蛋白质提取物 + DNA模板 有无DNA合成?? - dNTPs - Mg2+ (辅助因子) - ATP (能源) - 游离的3’OH端 (引物) 体外测定DNA复制
Okazaki的脉冲标记和脉冲追踪的实验结果分析
在复制叉中不连续合成的DNA片段称为冈崎片 段，连续合成的DNA子链被称为前导链，不连 续合成的DNA子链被称为后随链或滞后链。
参与DNA复制的主要酶 和蛋白质的结构与功能
① ② ③ ④ ⑤
⑥
⑦
DNA聚合酶 DNA解链酶 单链结合蛋白 DNA引发酶 DNA拓扑异构酶 DNA连接酶 端聚酶（真核生物特有）
DNA聚合酶
DNA聚合酶的全名是依赖于DNA的DNA 聚合酶，就是以DNA为模板，催化DNA 合成的聚合酶。 DNA聚合酶是参与DNA复制的主要酶， 该酶的许多性质直接决定了DNA复制的 一些基本特征。
DNA聚合酶
反应通式：
Mg2+ DNA + 引物-OH + dNTP DNA/引物-dNMP + PPi 5′ 3′ 随后的 PPi迅速水解驱动反应的进行
DNA复制的一般特征
① ② ③ ④
⑤
⑥ ⑦
⑧
⑨
以原来的DNA两条链作为模板，四种dNTP 为前体，还需要Mg2＋ 作为模板的DNA需要解链 半保留复制 需要引物——主要是RNA，少数是蛋白质 复制的方向始终是5′→3′ 具有固定的起点 多为双向复制，少数为单向复制 半不连续性 具有高度的忠实性和进行性
目前是Standford大 学医学院的终身教授
纯化得到DNA聚合酶I
DNA聚合酶I
一条肽链至少具有三种不同的酶活性！ 不可思议!!! 5′→3′外切核酸酶 3′→5′外切核酸酶 5′→3′DNA聚合酶
DNA聚合酶折叠成几个不同的结构域
Hans Klenow 使用枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶处理 DNA聚合酶I，结果得到大小两个片段：大片段被称 为Klenow片段或Klenow酶，含有大小两个结构域， 其中小结构域具有3′→5′外切酶活性，大结构域具有 5′→3′聚合酶活性；小片段只有5′→3′外切酶活性。 Tom Steitz等得到了Klenow酶的晶体结构
DNA复制可能的三种方式
由Meselson和Stahl设计证明半保留复 制的实验被誉为生物学最美丽的实验
Meselson 和Stahl的证明DNA半保留复制的实验流程
Meselson 和Stahl的实验结果
Meselson与Stalh在42年以后在最初 他们相遇的一颗树下重逢时的合影
Taylor以蚕豆根尖细胞为材料、使用放射性同 位素证明真核细胞DNA也是半保留复制的实验。
某些生物DNA复制的引物序列
证明DNA复制的方向始终是5′→3′的末端终止实验
DNA复制起始区的特征
①
②
③
由多个短的重复序列组成； 能够被多亚基的复制起始区结合蛋白识别； 通常富含AT碱基对，这有利于DNA复制起 动时的解链，因为AT碱基对含有的氢键数目 低于GC碱基对。
细菌和酵母DNA复制起始区的特征
Cairns证明大肠杆菌DNA双向复制的实验
Reiji Okazaki的实验
脉冲标记——目的在于即时标记在特定 时段内合成的DNA。 脉冲追踪——目的则是要弄清那些被标 记上的DNA片段后来的去向。
Okazaki的脉冲标记和脉冲追踪的实验
Okazaki的脉冲标记和脉冲追踪的实验结果分析
结论：一定有其他DNA聚合酶。生化学家很 快从polA突变体纯化到新的DNA聚合酶
DNA聚合酶I的功能究竟是什么？
在多种需要短DNA合成的过程中起作用 在DNA修复中起主要作用 在DNA复制中，去除RNA引物，并填补随后留下 的空缺。
对DNA聚合酶I更多的认识
为什么具有3′→5′外切核酸酶?
Klenow酶的晶体结构模型
切口平移
DNA聚合酶I所具有的5′→3′聚合酶和5′→3′外切酶活性的联合使用可 导致一个具有切口的DNA分子发生切口平移。如果在切口平移反应 中加入放射性标记的dNTP，则放射性标记的核苷酸会参入到重新合 成的DNA链上，从而使DNA的一条链带上同位素标记。
DNA 聚合酶I是不错，然而….
1969年，John Cairns等人 分离到一种大肠杆菌突变株 其DNA聚合酶I活性只有野生型的1% (polA 基因突变) 突变体对UV辐射极为敏感 其他一切正常 细胞照常分裂 结论:
DNA聚合酶I不是大肠杆菌DNA复制的主要聚合酶
其他线索….
速度太慢 酶量太多 进行性不够高——聚合酶的进行性是指一种聚合 酶从与DNA模板结合到与模板解离的这段时间内 催化参入到DNA链上的核苷酸数目。显然，DNA 聚合酶的进行性越高，催化复制的效率就越高。 聚合酶I的进行性平均值为20nt~50nt，远远低于 DNA复制的实际值。