用酶解酵母细胞壁

酿 酒 酵 母 载 体 的 种 类 和 构 建
(1). YIp载体－酵母整合型载体
该类载体依靠本身携带的某种酵母基因与酵母染色体上的同
源DNA发生同源重组而整合到染色体上去。这种转化体十分稳定， 但转化率低（１－１０个转化子／微克ＤＮＡ）．由ＣｏｌＥ１ 质粒和酵母提供的基因（亮氨酸lue2）构成．
YCp-Yeast Centrometric plasmid ** 若在YCp 或YRp 中插入一段酵母的端粒结构，该 质粒称之为YLp-Yeast Linear plasmid *** 若将YLp质粒构建成环状分子,该质粒称之为 pYAC载体(Yeast Artificial Chromosome)
载 体 的 整 合
(2). YRp载体－酵母复制型载体
1）酵母染色体复制子（ARS）
酵母染色体总长为15,000 kb,根据电镜观察结果预计有 400个复制起点，根据基因克隆分离ARS的实验结果估计有 480个ARS。
2） YRp７由ｐＢＲ３２２质粒和酵母提供的基因（色氨酸ｔ
ｒｐ１）、复制子（ARS）构成．
(2)利用Li+盐进行转化： 这种方法不需要消化酵母的细胞 壁，产生原生质球，而是将整个细胞暴露在Li+盐(如0.1 mol／L LiCl)中一段时间，再与DNA混合，经过一定处理 后，加40％PEG4000，然后经热应激等步骤，即可获得 转化体。
8.2 用于转化子筛选的标记
大多数是以酵母菌氨基酸或碱基合成途径中的结构 基因作为选择标记，如lue2，trp1， his3和 ura3 。 使用这些遗传标记时，受体菌应是相应标记基因的 突变型，且是稳定的突变体（缺失突变或多点突 变），利用遗传互补进行转化体选择的。
组氨酸his3—咪唑磷酸甘油脱氢酶; 亮氨酸lue2—β-异丙基苹果酸脱氢酶; 赖氨酸lys2—β-氨基已二酸还原酶; 色氨酸trp1—N-邻氨基苯甲酸异构酶; 尿嘧啶ura3—乳清苷-5`-磷酸脱羧酶;
亮氨酸lue2—β-异丙基苹果酸脱氢酶
该酶是把丙酮酸转化成亮氨酸的代谢酶之 一．只要使用亮氨酸lue2突变的营养缺陷型 酵母作受体，载体上带有亮氨酸lue2基因就 能在不含亮氨酸的培养基上实现转化克隆的 筛选（书１７０页图）．
1-YEp13 探针; 2-2μ质粒探针; 3-LEU2探针; 4-pBR322探针
(4). YCp载体－－酵母着丝粒载体(YCp)
第一个着丝粒于1980年分离自第三染色体, 现已从酿酒酵 母菌中分离到多个着丝粒。着丝粒（ＣＥＮ）插入含有ＡＲ
Ｓ的质粒就形成YCp载体。可使质粒在子、母细胞中均匀
分配。
YRp的特点
i. 高频转化（１千－１万个转化子／微克ＤＮＡ）． ii. 转化子不稳定 iii. 子代细胞质粒分散不均匀 iv. 可整合到染色体中去，与YIp整合过程相同
YRp载体示意图
(3). YEp载体---酵母附加体型载体
1) 酵母2μ质粒
2μ 质粒的结构
2）YEp载体
YIp中可插入整个或部分2μ质粒DNA构成YEp。大多数酿酒酵 母菌株中都含有2μ质粒，YEp复制所需的酶可由2μ质粒提供。 YEp具有YRp载体相同的特点，它还可以与2μ质粒发生重组。重 组质粒不稳定，在无选择压力条件下可很快消失。利用此特点可 除去酵母菌株中的天然质粒。
8.1 酵母菌的特征
酵母菌是一群以牙殖或裂殖进行无性繁殖 的单细胞真核微生物。
酵母菌表达外源基因的优势
酵母菌基因组已测序，基因表达调控机理比 较清楚，遗传操作简单。
蛋白翻译后可修饰加工 安全性高 大规模发酵工艺简单，成本低 能将表达产物分泌到培养基中 特别适合于遗传分析
YCp载体结构
(5). YLp载体
真核细胞染色体的末端DNA有独特的性质：能使染色体保持 稳定，能成功地进行DNA复制。这种末端DNA称之为端粒（Ｔ
ＥＬ）。端粒结构与染色体其余部分的结构是不同的。 最先 用于构建YLp的端粒来自四膜虫的核糖体DNA，不同长度的YLp 具有不同的特点
(6). pYAC载体
2. 酵母克隆载体的结构与特点
1) 穿梭载体，YIp除外 2) 有适合两种生物的标记基因 3) 环状或线状DNA
酿酒酵母各种载体的特征
载体类型 存在方式 所需DNA序列 标记基因 转化频率
（菌落/μgDNA）
整合型 整合 与染色体DNA Apr Tcr
酵母菌人工染色体(yeast artificial chromosomYAC载体。 pYAC载体具有以下特点：
1） 双TEL位点； 2） 三个酵母菌遗传标记基因； 3）克隆能力大
pYAC载体的结构
* 若在YRp中插入酿酒酵母着丝粒序列，该种载体
8.3 酵母菌的载体系统
8.3.1 野生型酵母质粒: 2μm环状质粒，存在于酿酒酵母中，是 6318bp大小的野生型2μm长双链环状质粒， 其拷贝数达50-100。其上有复制起点、4个 基因、使质粒在细胞中稳定的STB序列。
8.3.2 酵母菌载体及构建
1.克隆载体的种类 1) 按复制方式划分 i. 自主复制型； ii. 整合型（非自主复制型） Yeast Integration plasmid(YIp) 2)按复制子来源划分 i. 附加体型- yeast episomal plasmid(YEp)，其复制起点来 自于酿酒酵母的天然质粒-2μ质粒 ii. 染色体复制型- Yeast Replicating plasmid(YRp)，其复制起 点来自染色体上的自主复制序列(ARS-autonomous replicating sequence)
酵母菌的选择
选择转化率高的菌株 选择回复突变频率低的菌株
酵母菌的转化
(1)利用酵母的原生质球进行转化 ： 首先，用酶解酵母细 胞壁，产生原生质球，再将原生质球置于DNA、CaCl2和 多聚醇(如聚乙二醇)中，多聚醇可使细胞壁具有穿透性， 并允许DNA进人。然后使原生质球悬浮于琼脂中，并使 其再生新的细胞壁。