基因重组,生物合成概念

基因重组
基因重组
是由于不同DNA链的断裂和连接而产生DNA片段的交换和重新组合，形成新DNA
分子的过程。

发生在生物体内基因的交换或重新组合。

包括同源重组、位点特异重组、转座作用和异常重组四大类。

是生物遗传变异的一种机制。

指整段DNA在细胞内或细胞间,甚至在不同物种之间进行交换,并能在新的位置上复制、转录和翻译。

在进化、繁殖、病毒感染、基因表达以致癌基因激活等过程中,基因重组都起重要作用。

基因重组也归类为自然突变现象。

基因工程是在试管内按人为的设计实施基因重组的技术,也称为重组DNA。

有目的的将一个个体细胞内的遗传基因转移到另一个不同性状的个体细胞内DNA分子,使之发生遗传变异的过程。

来自供体的目的基因被转入受体细菌后,可进行基因产物的表达,从而获得用一般方法难以获得的产品,如胰岛素、干扰素、乙型肝炎疫苗等是通过以相应基因与大肠杆菌或酵母菌的基因重组而大量生产的。

即基因重组
由于基因的独立分配或连锁基因之间的交换而在后代中出现亲代所没有的基因组合。

原核生物的基因重组有转化、转导和接合等方式。

受体细胞直接吸收来自供体细胞的DNA片段，并使它整合到自己的基因组中，从而获得供体细胞部分遗传性状的现象，称为转化。

通过噬菌体媒介，将供体细胞DNA片段带进受体细胞中，使后者获得前者的部分遗传性状的现象，称为转导。

自然界中转导现象较普遍，可能是低等生物进化过程中产生新的基因组合的一种基本方式。

供体菌和受体菌的完整细胞经直接接触而传递大段DNA遗传信息的现象，称为接合。

细菌和放线菌均有接合现象。

高等动植物中的基因重组通常在有性生殖过程中进行，即在性细胞成熟时发生减数分裂时同源染色体的部分遗传物质可实现交换，导致基因重组。

基因重组是杂交育种的生物学基础，对生物圈的繁荣昌盛起重要作
用，也是基因工程中的关键性内容。

基因工程的特点是基因体外重组，即在离体条件下对DNA分子切割并将其与载体DNA分子连接，得到重组DNA。

1977年美国科学家首次用重组的人长激素释放抑制因子基因生产人生长激素释放抑制因子获得成功。

此后，运用基因重组技术生产医药上重要的药物以及在农牧业育种等领域中取得了很多成果，预计下世纪在生产治疗心血管病、镇痛和清除血栓等药物方面基因重组技术将发挥更大的作用。

从广义上讲,任何造成基因型变化的基因交流过程,都叫做基因重组。

而狭义的基因重组仅指涉及DNA分子内断裂—复合的基因交流。

真核生物在减数分裂时,通过非同源染色体的自由组合形成各种不同的配子,雌雄配子结合产生基因型各不相同的后代,这种重组过程虽然也导致基因型的变化,但是由于它不涉及DNA分子内的断裂c复合,因此,不包括在狭义的基因重组的范围之内。

根据重组的机制和对蛋白质因子的要求不同,可以将狭义的基因重组分为三种类型,即同源重组、位点特异性重组和异常重组。

同源重组的发生依赖于大范围的DNA同源序列的联会,在重组过程中,两条染色体或DNA分子相互交换对等的部分。

真核生物的非姊妹染色单体的交换、细菌以及某些低等真核生物的转化、细菌的转导接合、噬菌体的重组等都属于这种类型。

大肠杆菌的同源重组需要RecA蛋白,类似的蛋白质也存在于其他细菌中。

位点特异性重组发生在两个DNA分子的特异位点上。

它的发生依赖于小范围的DNA同源序列的联会,重组也只限于这个小范围。

两个DNA分子并不交换对等的部分,有时是一个DNA 分子整合到另一个DNA分子中。

这种重组不需要RecA蛋白的参与。

异常重组发生在顺序不相同的DNA分子间,在形成重组分子时往往依赖于DNA的复制而完成重组过程。

例如,在转座过程中,转座因子从染色体的一个区段转移到另一个区段,或从一条染色体转移到另一条染色体。

这种类型的重组也不需要RecA蛋白的参与。

[编辑本段]
基因重组的类型
基因重组是指一个基因的DNA序列是由两个或两个以上的亲本DNA组合起来的。

基因重组是遗传的基本现象，病毒、原核生物和真核生物都存在基因重组现象。

减数分裂可能发生基因重组。

基因重组的特点是双DNA链间进行物质交换。

真核生物，重组发生在减数分裂期同源染色体的非姊妹染色单体间，细菌可发生在转化或转导过程中，通常称这类重组为同源重组(homologous recombination)，即只要两条DNA序列相同或接近，重组可在此序列的任何一点发生。

然而在原核生物中，有时基因重组依赖于小范围的同源序列的联会，重组只限于该小范围内，只涉及特定位点的同源区，把这类重组称作位点专一性重组(site-specific recombination)，此外还有一种重组方式，完全不依赖于序列间的同源性，使一段DNA序列插入另一段中，在形成重组分子时依赖于DNA复制完成重组，称此类重组为异常重组(illegitimate recombination)，也称复制性重组(replicative recombinati on)。

生物合成
生物合成 biosynthesis
生物体内进行的同化反应的总称。

生物合成具有如下几种不同的生理意义。

（1）合成生长增值所必需的物质。

（2）在稳定状态时，合成用于补充消耗掉的成分的物质。

（3）为长期和短期的贮藏，进行必要的合成。

一般来说，生物合成是吸能反应，多数是朝向使分子结构复杂化的方向进行。

能量供给最典型的是由ATP供给，也有通过GTP（例如：蛋白质合成，）UTP（糖合成），CTP（磷脂的合成）供给的。

也有利用还原型辅酶的（脂肪链的延长）。

生物合成可分为由主要原料进行的全合成（从头合成，例如光合作用）和由部分分解产物进行可逆性的废物利用途径（例如：嘌呤核苷酸的转换。

生物体内的各种生物合成途径互相间受到复杂的控制。

质粒
质粒(Plasmid)
质粒是细菌染色体外的遗传物质，为环形闭合的双股DNA,存在于细胞质中，质粒编码非细菌生命所必须的某些生物学性状，如性菌毛、细菌素、毒素和耐药性等。

质粒具有可自主复制、传给子代、也可丢失及在细菌之间转移等特性，与细菌的遗传变异有关。

质粒是真核细胞细胞核外或原核生物拟核区外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸(DNA)分子。

现在习惯上用来专指细菌(大肠杆菌）、酵母菌和放线菌等生物中细胞核或拟核中的DNA以外的DNA分子。

在基因工程中质粒常被用做基因的载体(Vector)。

许多细菌除了拟核中的DNA外，还有大量很小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)（补充：部分质粒为RNA）。

质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。

有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进真菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。

质粒在宿主细胞体内外都可复制！
目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA 分子(简称cccDNA)。

细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%～3%。

根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。

每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。

按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒；另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。

这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成还会使质粒拷贝数增至几千份。

如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。

一般分子量较大的质粒属严紧型。

分子量较小的质粒属松弛型。

质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。

在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。

人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。

常用的人工质粒运载体有pBR32 2、pSC101。

pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。

如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。

但是如果将DNA片段插入到Hind III、Bam H I 或 Sal I切点，就会使抗四环素基因失活。

这时，含有DNA插入片段的pBR322将使宿主细菌抗氨苄青霉素，但对四环素敏感。

没有DNA插入片段的pBR322会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素，而没有pB R322质粒的细菌将对氨苄青霉素和四环素都敏感。

pSC101与pBR322相似，只是没有抗氨苄青霉素基因和PstI切点。

质粒运载体的最大插入片段约为10 kb(kb表示为千碱基对)。

1973年，科学家将质粒作为基因的载体使用，为基因工程的诞生奠定了基础。

最常用的质粒是大肠杆菌的质粒。

这种质粒常含有抗生素抗性基因，例如，卡那霉素抗性基因。

pBR322质粒
pBR322质粒DNA分子的长度为4363bp，此载体中有两个标记基因，一个是氨苄青霉素抗性基因（Apr），另一个是四环素抗性基因（Tetr）。

现在已知pBR322DNA分子共有24种核酸内切限制酶的单一识别位点。

其中7种限制酶（从12：00位置按顺时针方向）即EcoRV、NheI、BamHI、SphI、SalI、XmaIII和NruI的识别位点位于四环素抗性基因内部，另
外有2 种限制酶即ClaI和HindIII的识别位点是存在于这个基因的启动区内，在这9个限制位点上插入外源DNA都会导致tetr的失活。

3种限制酶即ScaI、PvuI和PstI的识别位点位于氨苄青霉素抗性基因内，在这些位点插入外源DNA则会导致ampr基因的失活。

由pBR322质粒载体的结构可知其具有如下优点：（1）具有较小的分子量。

经验表
明，为了避免在DNA的纯化过程中发生链的断裂，克隆载体的分子大小最好不要超过10 Kb。

pBR322质粒这种小分子量的特点，不仅易于自身DNA的纯化，而且可容纳较大的外源DNA片段；（2）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号，能指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞以及外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。

标记基因往往可以赋予宿主细胞一种新的表型，这种转化细胞可明显地区别于非转化细胞。

当我们把一个DNA片段插入到某一个标记基因内时，该基因就失去了相应的功能。

当把这种重组DNA分子转到宿主细胞后，该基因原来赋予的表型也就消失了。

要是仍保留了原来表型的转化细胞，细胞内含有的DNA分子一定不是重组子。

很显然，既要指示外源DNA 是否进入了宿主细胞，又要指示载体DNA分子中是否插入了外源DNA片段，那么这种载体必须至少具有两个标记基因。

另外，pBR322质粒载体还具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后，每个细胞中可积累1000~3000个拷贝，这就为重组体DNA的制备提供了极大的方便。

pBR322质粒载体的构建
pBR322质粒载体的构建过程可简单地概括如下：
1、由于pBR322质粒的亲本之一是pMB1质粒，故首先以pMB1为基础，引入Rldr d19质粒的Tn3易位子，得到13.3kb的pMB3质粒；
2、pMB3的分子量显然使得它不适合作为载体，所以要通过在EcoRI活性条件下的消化让它大部分的无用片段失去，留下来的小片段的DNA的黏性末端连接起来后就形成了pMB8质粒（2.6kb）；
3、此时，另外一种pSC101质粒在EcoRI活性条件下消化产生了含有tetr抗性的D NA片断，这个片断和pMB8整合在一起就形成了pMB9质粒（5.3kb）。

此时pMB9为a mpstetr表型；
4、pMB9已经初步具备载体的功能，为了让它更加完善，我们要让它具备amprtetr 性能，即在pMB9上引入pSF2124的Tn3易位子，但Tn3可以来也可以走，为了留住它，我们切去了Tn3中表达转位酶的基因，形成了pBR313质粒。

此后我们兵分两路：一路把pBR313的PstI位点除去，使之成为ampstetr表型的pB R318质粒；
5、；另一路把pBR313的EcoRII的位点切除，使之成为amprtets表形的pBR320质粒。

由此我们的到了两种功能互补的质粒，这样我们只要将他们杂交就可以得到一种接近全能的载体质粒了，这就是pBR322 。

pBR322的应用
了解了pBR322的结构和它的构建过程之后，我们来看pBR322在基因工程中的应用。

pBR322质粒作为一种常用的基因克隆载体，在实际应用中有着非常重要的地位，其中一个突出的例子就是应用pBR322 作为克隆载体对水稻的叶绿体光诱导基因psbA 进行结构分析。

将水稻叶绿体的DNA，用EcoRI核酸限制性内切酶消化之后，放入含有溴化乙锭的低熔点（LMP）的1%琼脂糖凝胶中作电泳分离。

从LMP中分离出分子大小为1.8～2.5kb 之间的DNA片段，再与同样经过了EcoRI核酸限制性内切酶切割并用碱性磷酸酶作了脱磷酸处理的pBR322质粒连接。

然后，将混合物转化到大肠杆菌5346菌株，培养在氨苄青霉素选择平板上，形成Ampr转化子菌落群体。

这样就构成了由EcoRI核酸限制性内切酶切割的水稻叶绿体DNA基因组库。

用Ampr转化子菌落与32P放射性标记的玉米psbA DNA 探针作菌落杂交，可以分离出其中的阳性克隆体。

从这些阳性克隆体中分离出来的重组体质粒DNA，经过进一步的分析，就能测出水稻叶绿体基因psbA的序列。

利用pBR322作为载体重组人体的抑生长激素也是一个经常提到的应用例子。

其过程和水稻叶绿体基因重组大同小异，只是除了在质粒载体上插入抑生长激素基因外，还将含有lac操纵子起始部分的片段（包括启动子、操纵区、核糖体结合位点和β－半乳糖苷酶的主要部分）插在抑生长激素基因的旁边。

由于有了lac操纵子的控制，重组基因产生的蛋白质的调节就变得比较容易了。