;伤寒杆菌;痢疾杆菌
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意义:是鉴别细菌的重要依据。
糖发酵试验
碳水化合物 代谢试验
甲基红试验 V-P试验
生 化
碳源和氮源 利用试验
反
IMViC试验
枸橼酸盐利用试验
应
蛋白质和氨基
吲哚试验
酸代谢试验
硫化氢试验
各种酶类试验:源自文库尿素酶实验
抑菌试验
(一)糖发酵试验
[原理]
根据细菌分解利用糖能力的差异 表现出是否产酸产气作为鉴定菌 种的依据。是否产酸,可在糖发 酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫 (其pH在5.2以下呈黄色,pH在 6.8以上呈紫色),经培养后根据 指示剂的颜色变化来判断。是否 产气,可在发酵培养基中放入倒 置杜氏小管观察。
红色为阳性,+
验
不出现红色为阴性,-
对照
大肠杆菌:+ 产气杆菌:—
3. V-P试验 葡萄糖
丙酮酸
乙酰甲基甲醇
V-P试剂
二乙酰 与蛋白胨培养基精氨酸中的胍基 反应生成红色化合物
培养基变红 产气杆菌
[方法]
取出试管培养物,加入等量的李氏试剂,摇匀后 不加塞,静置30分钟观察结果。
阴性
阳性
[结果]
VP 试
主要实验材料
1.大肠杆菌,白色葡萄球菌培养物 2.含抗生素的滤纸片:
青霉素 氯霉素 链霉素 庆大霉素 3.普通平板,细菌接种工具,培养箱
方法步骤
1.标记分区; 2.密涂接种; 3.贴药敏纸片; 4.培养; 5.结果观察。
1.标记分区
2.密涂接种
3.贴药敏纸片
4.培养
置37℃温箱, 培养18-24h。
1. 吲哚试验
[原理]
色氨酸几乎存在于所有的蛋白质中,某些细菌含色氨 酸酶,能将分解蛋白胨中的色氨酸而生成靛基质(吲 哚)。后者与寇氏试剂中对二甲基氨基苯甲醛作用,形 成红色。
[方法]
将大肠杆菌、产气杆菌分别接种在蛋白胨水培养基中, 37℃培养24-48小时取出,在上述细菌的培养液内各加 入寇氏试剂数滴,略加振摇,静止半分钟后观察结果。
实验材料
1.肠道致病菌的鉴定: 玻片每人2张; 革兰染液; 沙门菌属多价O血清(1套/班); 双糖铁培养基(2支/组,18支/室); 大肠,伤寒,痢疾三种细菌在双糖铁培养基上的生长现象 示教(每个教室1组)。
2.药敏实验: 菌液(1个/组,8个/室)。 固体平板(2个平板/组,19个/室); 药敏纸片(1套/班)。 药敏实验的示教板(1个/室,共8个)。
五、 结果
抑菌圈直径
操作内容
1.两人1个平板 2.密涂接种大肠杆菌,贴片,标记及培养
三、肠道杆菌的鉴定
采集标本
病
增菌培养
分离培养
革兰染色
原
菌
革兰染色
接种琼脂斜面纯培养
的
检 验 程 序
观 察 菌 落 特
生 化 试 验
血 清 学 试 验
动 物 试 验
征
分析鉴定
细菌的生化反应
概念:用生化的方法来检测细菌对各种基质 的代谢作用及代谢产物,借以鉴别细菌种类, 这种生化试验称为细菌的生化反应试验。
微量细菌生化鉴定管
[方法]
取糖发酵管培养基,此时培养基应呈澄清、紫色,倒 立小管内无气泡,接种细菌后置37℃温箱培养18-24小 时,观察结果。
[结果]
1、确定细菌是否生长 2、产酸,则培养基指示剂(溴甲酚紫)变为黄色,以“+”
表示。 3、产酸又产气,则培养基除变黄外,在倒置的小管中有气
泡,用“ ”表示。 4、不发酵糖类,培养基仍为紫色,小管内无气泡,以“-”
鲎
horseshoe crab
原理: 鲎是一种海洋节肢动物,其血液中含有一种有核变形细 胞,这种细胞的胞浆中含有凝固酶原和凝固蛋白原。
内毒素(LPS)
凝固酶原
凝固酶
激活
凝固蛋白原 凝固蛋白 (溶解状态) (凝胶状态)
材料: 鲎试剂 内毒素试剂 鲎试剂专用溶解水 无菌无热源质吸管
方法:(每四人两支鲎试剂,一支实验一支对照)
目的要求
1.掌握纸片扩散法药敏试验的原理及结果判定; 2.了解药敏试验的操作方法和意义。
原理
含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的 琼脂平板上,纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分 溶解后便不断地向纸片周围区域扩散,形成递减的 浓度梯度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生 长被抑制,形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映 测试菌对测定药物的敏感程度。
3.内毒素的检测(2人/组,2支鲎试剂,共38支鲎试剂/室)
实验三
一、内毒素的检测 二、药敏试验 三、肠道杆菌的鉴定
一、内毒素的检测
目的
1.掌握内毒素实验的原理和操作方法。 2.熟悉内毒素实验的意义。
检测方法
家兔发热法:比较烦琐,且灵敏度不高;
鲎实验法:灵敏度高,可检测小于10ng/ml 的内毒素。
验
红色为阳性,+
大肠杆菌:— 产气杆菌:+
无红色为阴性,-
4. 枸橼酸盐利用试验
培养基
枸橼酸盐
铵盐
碳酸盐
氨
培养基pH上升
溴麝香草酚蓝 呈碱性变色
培养基变蓝
产气杆菌
[结果]
深蓝色为阳性+
绿色为阴性-
枸 橼 酸 利 用 试 验
大肠杆菌:— 产气杆菌:+
(三)硫化氢产生试验
[原理]
某些细菌能分解蛋白质中的含硫氨基酸,如半胱氨 酸、甲硫氨酸,而生成硫化氢。硫化氢遇培养基中的 铅盐或铁盐,形成黑色的硫化铅或硫化亚铁沉淀物。
实
对
照
验
0.1ml溶解水+0.1ml内毒素
0.2ml溶解水
垂直放入37℃温箱,20-30分钟观察结果。
结果: 实验组出现凝固
对照组不出现凝固
内毒素检测的应用:
1.检测输液用品或生物制品中是否含有内毒素;
2.临床上检测患者是否有革兰氏阴性菌感染引 起的内毒素血症(内毒素休克)等。
二、药 敏 试 验
表示。
糖 发 酵 实 验
大肠杆菌 伤寒杆菌 副伤寒杆菌
葡萄糖
+
乳糖
-
-
(二)IMViC试验
是一组试验 靛基质试验或称吲哚试验(I)、甲基红试验(M)、V-
P试验(V)和枸橼酸盐利用试验(C)可缩写为IMViC试 验,i是为了发音的需要加入的。 常用于革兰阴性的肠道细菌检测中,可区分产气杆菌属 和大肠杆菌属 大肠杆菌++--;产气肠杆菌--++; 伤寒杆菌-+--; 痢疾杆菌-+--。
[结果]
大肠杆菌为阳性 伤寒杆菌为阴性
阴性
阳性
2.甲基红试验
葡萄糖 丙酮酸
大量混合酸
乙酰甲基甲醇(中性)
pH降至4.4以下
甲基红试剂
培养基变红 大肠杆菌
pH>5.4
甲基红试剂
培养基橘黄色
产气杆菌
[方法]
在大肠杆菌和产气杆菌培养物中滴加甲基红指示剂 数滴,立即观察结果。
阳性
阴性
[结果]
甲
基
红 试
糖发酵试验
碳水化合物 代谢试验
甲基红试验 V-P试验
生 化
碳源和氮源 利用试验
反
IMViC试验
枸橼酸盐利用试验
应
蛋白质和氨基
吲哚试验
酸代谢试验
硫化氢试验
各种酶类试验:源自文库尿素酶实验
抑菌试验
(一)糖发酵试验
[原理]
根据细菌分解利用糖能力的差异 表现出是否产酸产气作为鉴定菌 种的依据。是否产酸,可在糖发 酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫 (其pH在5.2以下呈黄色,pH在 6.8以上呈紫色),经培养后根据 指示剂的颜色变化来判断。是否 产气,可在发酵培养基中放入倒 置杜氏小管观察。
红色为阳性,+
验
不出现红色为阴性,-
对照
大肠杆菌:+ 产气杆菌:—
3. V-P试验 葡萄糖
丙酮酸
乙酰甲基甲醇
V-P试剂
二乙酰 与蛋白胨培养基精氨酸中的胍基 反应生成红色化合物
培养基变红 产气杆菌
[方法]
取出试管培养物,加入等量的李氏试剂,摇匀后 不加塞,静置30分钟观察结果。
阴性
阳性
[结果]
VP 试
主要实验材料
1.大肠杆菌,白色葡萄球菌培养物 2.含抗生素的滤纸片:
青霉素 氯霉素 链霉素 庆大霉素 3.普通平板,细菌接种工具,培养箱
方法步骤
1.标记分区; 2.密涂接种; 3.贴药敏纸片; 4.培养; 5.结果观察。
1.标记分区
2.密涂接种
3.贴药敏纸片
4.培养
置37℃温箱, 培养18-24h。
1. 吲哚试验
[原理]
色氨酸几乎存在于所有的蛋白质中,某些细菌含色氨 酸酶,能将分解蛋白胨中的色氨酸而生成靛基质(吲 哚)。后者与寇氏试剂中对二甲基氨基苯甲醛作用,形 成红色。
[方法]
将大肠杆菌、产气杆菌分别接种在蛋白胨水培养基中, 37℃培养24-48小时取出,在上述细菌的培养液内各加 入寇氏试剂数滴,略加振摇,静止半分钟后观察结果。
实验材料
1.肠道致病菌的鉴定: 玻片每人2张; 革兰染液; 沙门菌属多价O血清(1套/班); 双糖铁培养基(2支/组,18支/室); 大肠,伤寒,痢疾三种细菌在双糖铁培养基上的生长现象 示教(每个教室1组)。
2.药敏实验: 菌液(1个/组,8个/室)。 固体平板(2个平板/组,19个/室); 药敏纸片(1套/班)。 药敏实验的示教板(1个/室,共8个)。
五、 结果
抑菌圈直径
操作内容
1.两人1个平板 2.密涂接种大肠杆菌,贴片,标记及培养
三、肠道杆菌的鉴定
采集标本
病
增菌培养
分离培养
革兰染色
原
菌
革兰染色
接种琼脂斜面纯培养
的
检 验 程 序
观 察 菌 落 特
生 化 试 验
血 清 学 试 验
动 物 试 验
征
分析鉴定
细菌的生化反应
概念:用生化的方法来检测细菌对各种基质 的代谢作用及代谢产物,借以鉴别细菌种类, 这种生化试验称为细菌的生化反应试验。
微量细菌生化鉴定管
[方法]
取糖发酵管培养基,此时培养基应呈澄清、紫色,倒 立小管内无气泡,接种细菌后置37℃温箱培养18-24小 时,观察结果。
[结果]
1、确定细菌是否生长 2、产酸,则培养基指示剂(溴甲酚紫)变为黄色,以“+”
表示。 3、产酸又产气,则培养基除变黄外,在倒置的小管中有气
泡,用“ ”表示。 4、不发酵糖类,培养基仍为紫色,小管内无气泡,以“-”
鲎
horseshoe crab
原理: 鲎是一种海洋节肢动物,其血液中含有一种有核变形细 胞,这种细胞的胞浆中含有凝固酶原和凝固蛋白原。
内毒素(LPS)
凝固酶原
凝固酶
激活
凝固蛋白原 凝固蛋白 (溶解状态) (凝胶状态)
材料: 鲎试剂 内毒素试剂 鲎试剂专用溶解水 无菌无热源质吸管
方法:(每四人两支鲎试剂,一支实验一支对照)
目的要求
1.掌握纸片扩散法药敏试验的原理及结果判定; 2.了解药敏试验的操作方法和意义。
原理
含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的 琼脂平板上,纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分 溶解后便不断地向纸片周围区域扩散,形成递减的 浓度梯度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生 长被抑制,形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映 测试菌对测定药物的敏感程度。
3.内毒素的检测(2人/组,2支鲎试剂,共38支鲎试剂/室)
实验三
一、内毒素的检测 二、药敏试验 三、肠道杆菌的鉴定
一、内毒素的检测
目的
1.掌握内毒素实验的原理和操作方法。 2.熟悉内毒素实验的意义。
检测方法
家兔发热法:比较烦琐,且灵敏度不高;
鲎实验法:灵敏度高,可检测小于10ng/ml 的内毒素。
验
红色为阳性,+
大肠杆菌:— 产气杆菌:+
无红色为阴性,-
4. 枸橼酸盐利用试验
培养基
枸橼酸盐
铵盐
碳酸盐
氨
培养基pH上升
溴麝香草酚蓝 呈碱性变色
培养基变蓝
产气杆菌
[结果]
深蓝色为阳性+
绿色为阴性-
枸 橼 酸 利 用 试 验
大肠杆菌:— 产气杆菌:+
(三)硫化氢产生试验
[原理]
某些细菌能分解蛋白质中的含硫氨基酸,如半胱氨 酸、甲硫氨酸,而生成硫化氢。硫化氢遇培养基中的 铅盐或铁盐,形成黑色的硫化铅或硫化亚铁沉淀物。
实
对
照
验
0.1ml溶解水+0.1ml内毒素
0.2ml溶解水
垂直放入37℃温箱,20-30分钟观察结果。
结果: 实验组出现凝固
对照组不出现凝固
内毒素检测的应用:
1.检测输液用品或生物制品中是否含有内毒素;
2.临床上检测患者是否有革兰氏阴性菌感染引 起的内毒素血症(内毒素休克)等。
二、药 敏 试 验
表示。
糖 发 酵 实 验
大肠杆菌 伤寒杆菌 副伤寒杆菌
葡萄糖
+
乳糖
-
-
(二)IMViC试验
是一组试验 靛基质试验或称吲哚试验(I)、甲基红试验(M)、V-
P试验(V)和枸橼酸盐利用试验(C)可缩写为IMViC试 验,i是为了发音的需要加入的。 常用于革兰阴性的肠道细菌检测中,可区分产气杆菌属 和大肠杆菌属 大肠杆菌++--;产气肠杆菌--++; 伤寒杆菌-+--; 痢疾杆菌-+--。
[结果]
大肠杆菌为阳性 伤寒杆菌为阴性
阴性
阳性
2.甲基红试验
葡萄糖 丙酮酸
大量混合酸
乙酰甲基甲醇(中性)
pH降至4.4以下
甲基红试剂
培养基变红 大肠杆菌
pH>5.4
甲基红试剂
培养基橘黄色
产气杆菌
[方法]
在大肠杆菌和产气杆菌培养物中滴加甲基红指示剂 数滴,立即观察结果。
阳性
阴性
[结果]
甲
基
红 试