细胞凋亡研究进展

细胞凋亡研究进展
摘 要:
细胞凋亡、胀亡和坏死细胞死亡是细胞不可逆损伤的功能性定义，凋亡则是细胞死亡方式之一，而坏死代表活体局部组织在细胞死亡后所发生的终末变化的总和，是一种形态学诊断。除细胞凋亡外，还存在另一种细胞死亡方式，即“坏死样死亡”，称胀亡：“胀亡”（oncosis），即肿胀死亡（swelling death），其特点为细胞质肿胀和核溶解的细胞损伤过程。尽管仍有许多问题甚至是关键的问题没有搞清楚,但近几年的研究在凋亡信号转导途径、细胞凋亡的生化反应机制以及细胞凋亡的基因调控等方面都取得了显著的进展。
关键词：细胞 凋亡 线粒体 半胱氨酸蛋白酶

普遍认为细胞凋亡在肿瘤和其它疾病中具有重要的意义，目前在很多生物学领域进行广泛的研究。自1972年Kerr提出细胞凋亡这一概念后，从80年代末期开始成为肿瘤病因学、病理学研究热点，人们对细胞凋亡的认识逐渐深入，对细胞凋亡发生分子机理的了解越来越透彻，然而也发现这一过程远非原来想象的那样简单，而是包含了复杂的调控机制。
生物体内环境的稳定，不但依赖细胞增殖和分化，也依赖于细胞的凋亡。细胞凋亡（apoptosis）又称编程性死亡，是生物界重要的生命现象之一。从线虫至高等哺乳类动物，从胚胎至成人，从生理到病理，从生到死整个过程，体内不同的细胞多具有此种死亡形式。早在100多年前Carl Vogt 已发现这种死亡形式。1972年Kerr等人重新提出研究，并命名为凋亡（apoptosis）。其后在凋亡的形态学和生物化学等领域取得新的认识。
近期的研究在3方面有明确的进展。第一、从研究小线虫（C. elegans）凋亡调节基因，证实凋亡的发展是由遗传基因控制，其中以Ced-9, Ced-3和Ced-4基因的作用最先确定，哺乳动物也有相应的同源基因］。第二、阐明凋亡信号传递途径，特殊的死亡信号分子激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族（称为caspases），诱导细胞凋亡。第三，研究了凋亡和一些疾病的关系，了解疾病发病机制及应用凋亡理论和实践来防治疾病。

一、凋亡相关基因的克隆

细胞凋亡研究的快速发展得益于凋亡相关基因的发现。1986年，Tsujimoto教授在美国工作期间，首次克隆了与B型淋巴瘤相关的基因Bcl-2。后来有人证明Bcl-2基因在细胞凋亡调节中起关键作用。大量的细胞凋亡基因的克隆及其相互关系的研究是从实验动物线虫(Caenorhabditis elegans)中开始的。线虫成熟个体总共有 1090个细胞，在其发育过程中，其中有131个细胞会发生凋亡。这些细胞的死亡是受基因严密调控的。有

人分离了一些线虫突变体，这些突变体在发育过程中其本应凋亡的细胞不发生凋亡，从而导致了发育异常。哈佛医学院Horvitz教授实验室首先从线虫中克隆了凋亡相关基因，并发现Ced-3是caspase的一种类似物，Ced-4是一种新的凋亡调节蛋白。
有意义的是，科学家发现Ced-9不仅是线虫凋亡抑制因子，同时也是哺乳动物细胞Bcl-2的同源类似物。这表明了细胞凋亡机制在进化过程中的保守性。线虫细胞凋亡的研究确立了细胞凋亡的基本框架。目前知道，线虫中的Ced-3(哺乳动物细胞caspase类似物)和Ced-4(哺乳动物细胞中APAF-1类似物)为凋亡促进因子。其他的多数基因如Ced-1, Ced-2 ,Ced-5 ,Ced-6 ,Ced-7和Ced-10则负责死亡细胞碎片的吞噬和清除。具体地讲，Ced-6编码一种称为ABC(ATP-binding cassette)的转运蛋白，参与细胞质膜物质转运。Ced-7参与吞噬细胞与凋亡细胞的相互作用过程中的相互识别。Ced-2,Ced-5和Ced-10可能与细胞迁移有关。Ced-5编码一种DOCK180 (downstream of CRK，一种原癌蛋白)蛋白，负责吞噬细胞表面的牵张，以包裹和吞噬凋亡细胞。不同吞噬相关基因如何协调起来参与吞噬过程的分子机制目前尚不清楚。
Ced系列基因相互作用，调节细胞凋亡过程。可以说，线虫发育过程中细胞凋亡的研究为哺乳动物和人类细胞凋亡的研究奠定了基础。此后，科学家克隆了大量其他动物细胞凋亡相关基因，即线虫凋亡相关基因的类似物。当然，高等动物细胞凋亡调节机制更为复杂。
随着细胞凋亡形态的研究，细胞生化的改变也逐步被阐明。（1）钙离子和蛋白激酶改变：细胞内Ca2+的堆积和重新分布，细胞核内Ca2+的增多［4］， 激活核酸内切酶的活性，蛋白激酶C在不同细胞类别和不同周期活性表现不一。（2）核酸内切酶激活［5］把DNA内切成180碱基对倍数的核苷酸片段，呈梯状电泳现象。（3）组织谷氨酰胺转移酶的积累并激活。（4）细胞骨架如肌动蛋白的变化。（5）细胞表面糖链、植物血凝素与玻连蛋白受体增加，磷脂酰丝氨酸的外露改变细胞表面的生化特性。

二、细胞凋亡的信号转导

细胞凋亡的信号转导途径可分为受体介导和和非受体介导的凋亡途径两种:
1.受体介导的细胞凋亡
肿瘤坏死因子配体(TNF)及其受体(TNFR)超家族的成员在免疫调节中起着关键作用，有些成员在神经系统或其他器官发育中也起着重要作用。目前已克隆的TNF配体有18个，包括TNF、FasL、TRAIL (TNF related apoptosis-inducing ligand)等。这些配体多为跨膜蛋白，其胞外区能被金属蛋白酶( metalloproteinase)切割，变成可溶性蛋白汾子。这些分子可形成三聚体或病毒样多聚体来发挥其生物

学功效。FasL是一种分子量为40kD的二型跨膜蛋白，即N末端在胞浆，而有150氨基酸的C末端暴露在胞外。FasL与TNF超家族配基有20%～25%的氨基酸相同。FasL主要在眼睛前房室和睾丸中表达，并在CD8+Thl细胞、CD4+T细胞和一些NK细胞中被激活表达。它在细胞表面的存在时间很短，金属蛋白酶可将其细胞外面部分裂解，成为可溶的有功能分子。
2.非受体介导的细胞凋亡信号转导
细胞保持生理活性需要各种生存信号(surviving signals)。相邻细胞间信号和细胞外基质的丧失和变化，支持细胞生长的细胞因子等生长因子不足，多种病毒和多种临床化疗药物和放疗都能诱导细胞凋亡。多种化疗和放疗剂可直接引起细胞核DNA损伤，导致p53含量上升，p53水平的增加诱导促凋亡蛋白分子Bax增加和移位至线粒体外膜。这种移位的Bax能与线粒体上Bcl-2分子作用，促进线粒体细胞色素C释放和细胞凋亡的发生。p53还能诱导细胞周期依赖激活的抑制物P21产生，引起细胞周期停滞。如果 DNA损伤被修复，细胞周期停滞就能被解除，如果损伤不能被修复，则细胞开始凋亡。线粒体在非受体介导的细胞凋亡中起着关键作用。
3.细胞介导的细胞凋亡免疫细胞杀伤

并不是所有的细胞死亡形式都是细胞自杀性行为。在有些情况下，一种细胞能杀死另一种细胞。在人类和哺乳动物免疫系统中存在T淋巴细胞，它能杀死被病毒感染的细胞和其他受损伤的细胞。杀伤性 T细胞通过细胞膜表面受体识别病毒感染的细胞，如有一种杀伤性T细胞可被穿孔素(Perforin)介导，大量释放丝氨酸蛋白酶Granzyme B等，切割细胞内多种蛋白和激活凋亡中起重要作用的caspases，从而诱导细胞凋亡。T淋巴细胞还通过氧爆发释放大量的自由基来诱导细胞凋亡。


三、凋亡发展的中心问题

最近，凋亡发展过程的研究最关注的是线粒体的作用、蛋白酶系统的级联反应（caspase cascade）和各种死亡基因及其产物的调节作用。

1．线粒体：在原核细胞内线粒体前身是一种小的共生细菌，它控制细胞在有氧环境下的生活和死亡。这种共生菌的存在由不稳定至稳定及参加核基因谱变成专性共生，是细胞进化现象［12］。细胞内氧化磷酸化，能量代谢和抗活性氧化有赖于线粒体的功能。线粒体的早期改变为线粒体膜通透性变化和线粒体转膜电位（mitochondrial transmembrane potential）降低，膜间孔开放，离子通过，内膜H+梯度破坏，基质渗透压升高，线粒体体积扩大，外膜破裂。caspases活性蛋白释放至胞质引起caspases连锁反应；线粒体转膜电位降低， 呼吸链解偶联，过氧化阴离子产物增加，基质钙和谷胱甘肽外流，

可溶性膜间蛋白，包括Cyto c释放，激发胞质半胱氨酸蛋白酶的连锁反应，产生细胞凋亡或坏死。故线粒体膜间孔大小、线粒体转膜电位调节细胞凋亡。线粒体改变引起细胞死亡已知有3种机制：（1）电子传递、氧化磷酸化和ATP产生的破坏。（2）释放激发caspases家族的蛋白，如Cyto c。（3）改变细胞氧化还原潜能。死亡类型（凋亡和坏死）不同决定于线粒体的改变。例如，当激发因子如Bax、Ca2+、神经酰胺刺激线粒体，结果有二种，一是渗透性不平衡使线粒体肿胀，外膜破裂，电化学梯度破坏和ATP减少使细胞坏死。一是线粒体外膜透性增加，释放Cyto c，激发caspases蛋白溶解酶，产生细胞凋亡。

2．caspases蛋白酶：凋亡是一种进化过程中保留下来的细胞自杀，发生的机制是蛋白溶解系统活化，涉及一组半胱氨酸蛋白酶家族，称为caspases。caspases家族具有蛋白酶的生物学特性：如蛋白溶解作用是不可逆的；许多蛋白酶是由其原无或极少催化作用的前体合成，其量虽少，起着催化作用；存在阳性或阴性反馈作用；蛋白酶能调节自身的活性；蛋白酶有其相应的抑制剂；蛋白酶反应是特异性的等。蛋白酶前体可在天冬氨酸位点上被切断成3部份，H2N-端是抑制区域被移去，另一端COOH-端断裂成1大1小亚单位称为死亡区域，2大2小亚单位结合成活化酶，可以作用下游效应caspases，这种级联反应称为caspases cascade［。这种连锁反应的进行有赖于caspases的调节蛋白、辅助因子、反馈关系和阈限等控制。
天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspases)是Ced-3在哺乳动物细胞中的同源类似物。这一组蛋白酶结构相关，主要存在于细胞胞质中。目前已克隆出16个同源基因，它们的共同特征之一是在细胞内以酶原的形式存在，约30～50kD，这些酶原由一个大亚基和小亚基结构域组成。在caspase激活酶链中，上游的Caspase 8, 9, 10与调控蛋白如FADD和/或Apaf等相互作用，形成复合体。很可能这些复合物的形成促使caspase自动催化裂解，在天冬氨酸残基后的肽键特异切断，形成活性分子。被激活的上游caspase能进一步激活下游的效应分子(effector enzymes)如Caspase 3、6、7等。并不是所有的caspase都参与细胞凋亡，如Caspase 4, 5, 11, 12, 13，很可能参与炎症反应。caspase被激活后能特异切割细胞内多种底物，这些特异性底物包括:①信号分子如MEKK1、p21活化的激酶2、焦点粘附激酶、Raf-1和Akt等。②细胞凋亡调控蛋白如Bcl-2、 Apaf-1和DNA酶(DFF, DNA片段化因子)抑制剂(ICAD)等。ICAD的切割导致有活性的DFF释放并转移至细胞核，切割DNA，形成核小体，这是凋亡细胞特有的DNA阶梯(DNA Ladder)片段形成的主要原因。③细胞

周期调控蛋白如Rb(视网膜母细胞瘤蛋白，Retinoblastoma protein)、 Cyclin E等都能被切割。④结构分子如actin、 fodrin、gelsolin、lamin和细胞内重要的酶如DNA修复相关酶 PARP[多(ADP核酸糖)多聚酶，Poly (ADP-ribose) polymerase]等。
Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡调节中起检测点(check-point)作用。线虫Egl -1和Ced-9基 因是Bcl-2及其家族蛋白在人类和其他哺乳动物细胞中的同源类似物。目前已克隆出了24个Bcl-2家族蛋白基因(图8一3)。这个家族中包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。抗凋亡蛋白包括Bcl-2及同源蛋白Bcl-XL、Bcl-w、Mcl-1、Al和病毒编码蛋白BHRF1、LMW5-HL、ORF-16、KS-Bcl-2、ElB-19k等，它们多数具有 BHl、BH2、BH3和BH4结构域，其中BH4是抑制凋亡蛋白分子特有的结构域。促凋亡蛋白包括两个亚家族，即Bax亚家族蛋白和Bid亚家族蛋白（含有BH3结构域）。可见，BH3结构域为该家族所共有，并在促凋亡作用中起关键作用。最新的研究表明，人工合成的BH3短肽能诱导线粒体发生凋亡反应。

3．细胞凋亡的基因调控：目前发现的细胞凋亡有关基因有3类，促细胞凋亡基因、抑制细胞凋亡基因和在细胞凋亡过程中协助的基因。（1）ced基因［6］：线虫的ced-3和ced-4为促凋亡基因，哺乳类动物和ced-3相似基因为ICE，是一种半胱氨酸蛋白酶；ced-9是抑制凋亡基因，人的bcl-2和ced-9同源，可以抑制ced-3。ced-4是结合体（adaptor）。（2）bcl-2及其家族：bcl-2家族有Bcl-x，Bax，Bak，Bad等成员，形成Bcl-2-Bax-Bclx和Bax-Bad-Bcl-x 调控系统。bcl-2 可以防止凋亡产生，与肿瘤细胞增殖和癌变有关，部分成员如Bax有促进凋亡作用［16］。（3）ICE基因：是哺乳类动物促凋亡基因。ICE作用于Pro-IL-1β底物。抑制ICE的基因有Cowpox病毒的Crm A，能使其失去诱导细胞凋亡作用。Cpp32基因产物可以和ICE协同作用。（4）c-myc和h-ras基因：c-myc促进细胞凋亡，h-ras抑制细胞凋亡。（5）Fas和Fas配体（Fas-L）：Fas为死亡受体，Fas-L是T淋巴细胞产物，Fas和Fas-L结合诱导细胞凋亡。（6）p53基因：野生型诱导细胞凋亡，通过细胞凋亡抑制肿瘤的生长。它作用在细胞周期和细胞受损伤时，促使细胞凋亡。（7）Rb有抗凋亡作用，Rb使细胞周期停滞，也可阻断细胞内信息传递。 也有报道放射线诱导细胞凋亡可由Rb蛋白介导。

四、凋亡在疾病的防治中应用的可能性

应用caspases理论及凋亡发生机理探索防治疾病方法，正在从动物实验和临床两方面进行，药物研究也方兴未艾，但治疗成功的人体病例不多，目前用在临床防治的疾病包括如下几类：

1．脑缺血神经细胞凋亡可以用caspases抑制剂防止。如新生儿窒息［19］，老年脑缺血，老年痴呆

症（如Alzheimers病）可用药物预防神经元凋亡。

2．过度凋亡所致疾病的防治：神经退行性变疾病，视网膜退行性病变，移植排斥，自身免疫性疾病等由于过度凋亡引起细胞缺失，可用caspases抑制剂预防［14］。

3．肿瘤防治：肿瘤细胞常呈凋亡不足，化疗和放疗可诱导肿瘤细胞凋亡，通过活化caspases酶系统或活化死亡受体启动caspases系统，促进凋亡。应了解某种肿瘤细胞启动的caspases酶系统和正常细胞死亡caspases酶系统的差异，以便选择激发肿瘤细胞的caspases系统。另外，肿瘤细胞可能是bcl-2表达过度，p53表达不足或突变使肿瘤细胞死亡减少，也可据此设计治疗策略［8］。

4．心肌缺血，心肌梗死：在急性条件下，心肌纤维多为坏死，有些缓慢发展的心肌缺血可产生心肌细胞凋亡，通过了解凋亡的发生过程可以预防和治疗慢性心肌纤维死亡［8］。

5．有些病毒感染可以阻止细胞凋亡，使病毒得以在活细胞繁殖。利用病毒或其蛋白产生抑制caspases系统或利用小分子多肽来防止凋亡［8］。

探索防治与细胞凋亡有关的疾病，目前提出对肿瘤、老年痴呆、艾滋病、自身免疫病等，根据凋亡理论制定治疗策略。需依赖几个领域的研究进步：（1）根据不同疾病细胞凋亡过程特点设计治疗方案；（2）市场上能提供有关药物；（3）基因治疗，ICE／ced-3基因家族产品的应用；（4）凋亡的诊断和研究方法的改善，关键是了解不同caspases活化在细胞凋亡作用及其上、下游的各辅助因子的作用。


近年来，有关细胞凋亡的研究飞速发展，并有所突破。对caspases 系列的研究将更深入，caspases 上游基因和下游的作用底物及各种协作因子将一一被阐明。促caspases因子和拮抗因子将制成药品推向市场，由于对有关疾病产生细胞凋亡机制的深入了解，并找出其特异性，可应用于疾病的防治，成为治疗学新领域。因此，细胞凋亡理论和实践的研究将有广阔的天地。但尽管在过去数年中对凋亡机制的研究进展非常迅速，但仍有很多问题需要更进一步的了解。这主要包括以下几点：凋亡精确的生化机制及其不同的信号转导途径的调控；新的凋亡调控相关基因的发现；相关疾病如肿瘤中凋亡分子机制的异常；这些机制在疾病治疗中的意义等等。因此，要想搞清凋亡的复杂而精致的调控网络看来尚需时日。


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