可溶性糖的提取和薄层层析分离

可溶性糖的提取和薄层层析分离（综合型）

一、实验的目的：

1、糖类是自然界存在的数量非常多的有机化合物。它是构成植物躯体和细胞的必要物质，又是生命活动能量的主要来源，与植物体内各类物质代谢密切相关。分离鉴定植物组织中可溶性糖的种类及其变化，对于了解植物体内物质代谢和农产品的品质，具有重要意义。

2、掌握薄层层析的操作技术。本实验通过薄层层析法，分离鉴定植物组织中可溶性糖的种类。通过本实验，学习提取植物材料中可溶性糖的一般方法，掌握薄层层析的原理、技术及其在糖类定性鉴定中的应用。

3、了解薄层层析的原理、方法及应用。

二、实验原理

薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层分离。

植物组织中的可溶性糖可用一定浓度的乙醇提取出来，经去杂质手续除去糖提取液中的蛋白质等干扰糖测定的物质，获得较纯的可溶性糖的混合液。糖为多羟基化合物。具有较强的极性，在硅胶G层上展层时，与硅胶分子间有一定的吸附力。各种糖羟基多少不同，造成吸附力的差异。该吸附力的大小顺序为：三糖＞二糖＞已糖＞戊糖。根据吸附层析原理，极性不同的糖在硅胶G层上展层时，具有不同的R f值，通过比较，即可分离开极性不同的糖并且鉴定植物样品提取液中糖的种类。

三、器材与试剂

（1）硅胶

（2）乙酸乙酯（3）石油醚

（4）苯胺——二苯

胺——磷酸显

色剂：2g二苯

胺，加2mL苯

胺，10mL

85％磷酸，

1mL浓盐酸，

100mL丙酮，

溶解后摇匀，

置于棕色瓶中

备用。

（5）CMC

（6）0.1mol/L 硼

酸溶液：称

6.18g溶解后

定容至 1

000mL；每组

30mL。（7）氯仿：冰乙酸：

水=30：35：5 （8）1％标准糖溶

液（10mg／

mL）：葡萄糖，

蔗糖，麦芽糖，

木糖

（9）毛细管

（10）碾钵

（11）载玻片

（12）搅拌棒

（13）称量勺

（14）电吹风

（15）展开缸

（16）量筒：100mL （17）恒温水浴（18）涂布器

（19）烘箱

（20）喷雾器

（21）吹风机

（22）小麦面粉

四、实验步骤

1、铺板硅胶G薄板的制备

称取硅胶G粉10g，羧甲基纤维素钠0.1g，加入0.1mol/L硼酸溶液35mL，于研钵充分研磨，进行涂布制作，薄层的厚度大约为0.25mm。铺层后的薄板放在80-100℃烘箱中烘干，取出后放在干燥器备用，也可以室温下风干过夜，用前于110℃烘箱中活化1小时使用。

铺板用的匀浆不宜过稠或过稀：过稠，板容易出现拖动或停顿造成的层纹；过稀，水蒸发后，板表面较粗糙。匀浆配比一般是硅胶G:水=1：2～3，硅胶G:羧甲基纤维素钠水溶液=1:2。研磨匀浆的时间，根据经验来定，与空气湿度有关，一般通过拿起研棒时匀浆下滴的情况来判断，越稠越难下滴。匀浆的稀稠除影响板的平滑外，也影响板涂层的厚度，进一步影响上样量。涂层薄，点样易过载；涂层厚，显色不那么明显。通常，板的质量对薄层鉴别的影响不是很大，影响最大的是展开剂的配制和展开系统的饱和。

2、面粉中可溶性糖提取液的制备

称取小麦面粉5g，放入100mL烧杯中，加入40mL水搅匀，置于50℃恒温水浴中浸提1h。倒入大离心管中，3 000r／min，离心5min，上清液即为糖抽提液。

3、面粉提取液中可溶性糖的分离鉴定

取活化过的硅胶G玻板一块，在距底边0.2cm水平线上确定2个点，相互间隔0.2-0.3cm其中1个点点上木糖、葡萄糖、麦芽糖和蔗糖标准混合溶液各3μL或适量，另一个点点上面粉提出液3μL或适量。

点样尽量用小的点样管。如果有足够的耐性，最好只用1微升的点样管。这样，点的斑点较小，展开的色谱图分离度好，颜色分明。点好样的薄层板用电吹风的热风吹干或放入干燥器里晾干。

点样时候应该注意：①选均匀平整的硅胶板点样；②不能划起始线；③确保样点点上d≤0.3cm。

4、展开

等待样点干燥，混匀试剂后放入展开；

展开系统的饱和：一般使用的是双槽的展开缸，一槽用来放展开剂（石油醚），另一槽可加入氨水或硫酸。把待展开的板放入两槽间的平台，斜架着，盖上展开缸的盖子。让展开剂的蒸汽充满展开缸，并使薄层板吸附蒸汽达到饱和，防止边沿效应，饱和时间在半个小时左右。展开时难免要打开盖子把薄层板放入展开剂中，不过对薄层板与蒸汽的吸附平衡影响不大，当然动作应该尽量轻、快。

展开后取出划下溶剂前沿线。

展开剂配制选择合适的量器把各组成溶剂移入分液漏斗，强烈振摇使混合液充分混匀，放置，如果分层，取用体积大的一层作为展开剂。绝对不应该把各组成溶液倒入展开缸，振摇展开缸来配制展开剂。混合不均匀和没有分液的展开剂，会造成层析的完全失败。

本次实验以氯仿：冰乙酸：水=30：35：5为展层剂上行展层，当展层剂前沿达距薄板顶端1cm处，停止层析。

5、显色。计算R f值并判断。

取出玻璃板以吹风机吹干。然后以苯胺一二苯胺—磷酸喷雾，于85℃烘箱中烘10min，各种糖即显出不同颜色，与标准糖比较，根据色斑颜色及R f值即可鉴定出面粉提取液中所存在的可溶性糖种类。

R f = 原点到层析斑点中心距离原点到溶剂前沿中心距离

五、思考题

1、薄层层析的原理是什么？本次实验中薄层层析是根据被分离物质的哪些性质进行分离的？

2、什么是比移值（R f值）？其作用是什么？

3、出现的色带分别是什么？

4、你这次的实验可以怎么样使用到大规模的工业化生产中？