DNA多态性分型技术

以 PCR 技术为背景，以人工合 成的碱基顺序随机排列的寡核苷 酸单链为引物，对所研究的基因 组 DNA 进行 PCR 扩增，经电泳 分离后产生DNA指纹图谱。
基本原理
模板 DNA 经 92 ～ 94℃变性解链后，在较低温度 下退火，此时，有许多位点能与随机合成的短 引物互补而形成双链结构。如果某两位点间在
②不能完全区分基因非常相似，甚至只有一 个核苷酸差异的生物类型。
RFLP与PCR-RFLP的应用
1.结 核 分 枝 杆 菌 IS6110-RFLP 分 析
2.厌 氧 菌 16SrRNA 基 因 PCRRFLP分析 3.其他
二、随机扩增多态性DNA 分析技术
random Amplified Polymorphism DNA， RAPD
核酸分子杂交技术原理
核酸经加热变性后，在低于变性温度 20℃~ 30℃时，反应系统中加入的核酸探针 与待测核酸样品中具有互补序列的单链 DNA
或 RNA 形成双链结构，通过检测标记信号即
可检测特定的核苷酸片段。
根据探针上的标记，可用放射自显影 或加入酶底物显色的方式观察结果。
优缺点
优点
1．可靠性较高 2．来源于自然变异 3．标记覆盖面广
多态性（ polymorphism ）是指在一个生物 群体中，同时和经常存在两种或多种不连续 的变异型或基因型或等位基因，亦称遗传多 态性（genetic polymorphism）或基因多态 性。
从本质上来讲，多态性的产生在于基因水平 上的变异，一般发生在基因序列中不编码蛋 白的区域和没有重要调节功能的区域。
④操作简便，快速；
⑤DNA分析效率较高；
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⑥所需DNA样品少。
缺
点
①重复性不高（最大缺点）；
②只能区分不同大小的片段，而不能区分有 不同碱基序列但大小相同片段；
③需对引物进行筛选，难以进行标准化。
三、细菌基因组重复 序列PCR技术 （repetitive-element PCR, rep-PCR）
位点分布发生相应变化，而使 PCR 产物增加、 减少或发生分子量改变，产生多态性图谱。
总DNA提取 随机引物合成 PCR扩增 随机引物筛选 电泳检测
图谱分析
优
点
①采用随机引物，无需预先知道被研究生物 基因组核苷酸序列；
②引物短，在整个基因组内的结合位点多， 2种甚至多种引物可混用； ③成本较低；
DNA多态性对微生物有哪些实际意义？ 将导致
——不同的细菌亚型
——耐药菌株出现
——毒力变异株出现
——抗原漂移与抗原变异
。。。。。。
在疾病预防控制中的应用
同源性追踪 细菌分型 传染控制
DNA多态性分析常用的方法
限制性片段长度多态性分析
随机扩增多态性DNA分析技术 细菌基因组重复序列PCR技术 扩增片段长度多态性分析技术（自学要考） 脉冲场凝胶电泳 。。。。。。
内切酶的命名规则
前三个字母代表其来源的细菌种名，用
斜体字母，第四个字母代表菌株名称，
如果同一株菌有不同限制性内切酶系统，
则不同的内切酶系用罗马数字区分。
例： EcoRI 代表该酶来源于 E. coli
的R菌株。
琼脂糖凝胶电泳槽和电泳仪
转移电泳槽
核酸分子杂交的概念及原理
核酸杂交: 两个不同来源的、含有互补核苷酸顺序 的单股核酸分子，通过碱基配对形成一 个新的、稳定的双股分子的过程。
可扩增范围之内，且分别位于互补的两条单链
上 ， 并 且 与 引 物 的 3’ 端 相 对 应 ， 就 可 以 通 过 PCR得到一个扩增产物。
基本原理
RAPD所用的一系列DNA引物序列各不相同，但 对于任意特定引物，它同基因组 DNA 序列有其 特定结合位点，如果基因组在这些区域发生片段
插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合
基本程序
根据基本原理思考基本程序？ 1. 提取DNA 2. 设计特异引物进行目的基因PCR反应
3. 将DNA扩增产物选用合适限制性内切酶酶 切
4. 将酶切出来的具各种长度的DNA片段在琼 脂糖凝胶上电泳分离 5. 对显示出来的带谱进行分析。
优缺点
优点： ①敏感性高。
②操作简便省时。
缺点：
①影响因素较多。
一、限制性片段长度多态性分析
restriction fragment length polymorphism， RFLP
—— 以 DNA-DNA 杂交为基础的第一代遗传 标记，是限制性内切酶、核酸电泳、印迹技 术、探针-杂交技术的综合应用
基本原理
每种生物基因型具有其独特的特征，及独特的限
制酶识别序列分布，其基因组 DNA 在限制性内
切酶作用下，产生相当多的大小不等片段，这些
片段经电泳以后几乎是连续排列的，如用放射性
同位素标记的 DNA 作探针，将与被标记的 DNA
相关的片段检测出来，即可构建出多态性图谱。
基本原理
因此，RFLP即是基于限制性核酸内切酶 酶切消化核酸及标记的 DNA 探针能与任 何序列相似的片段杂交，通过片段长度 变异性来检测生物体多态性。
提取基因组DNA
制性内切酶酶切
基本 方法
琼脂糖凝胶电泳
DNA变性、转膜、固定
核酸杂交
显影、显色、分析
限制性内切酶
(restriction endonuclease ， RE）
一类能识别环状或线性双链 DNA特定
核苷酸序列的DNA水解酶，在合适反应条
件下，使每条链的一个磷酸二酯键断开，
产生多种可测量的寡核苷酸片段的酶。
缺点：
①检测步骤多，周期长；
②对DNA需求量大，一般需要5~l0μg， 纯度要求较高； ③技术复杂，操作繁琐，工作量大； ④具有放射性的危害；
⑤检测成本高。
讨论： RFLP与脉冲场凝胶电泳都是根据 基因组上的限制性内切酶位点的 多态性来对生物进行基因分型的， 那么它们两者的异同点有哪些呢？
基于上述RFLP的缺点，一种更好的 分析技术 —— 聚合酶链反应 - 限制性 片段长度多态性分析技术 （ PCRRFLP ）应运而生。
基本原理
根据名称： PCR-RFLP猜想本方法的原理？ 结合PCR技术与 RFLP技术的优点，其基本原 理是对目的基因片段 PCR 扩增后，利用多种
限制性内切酶，对扩增产物进行酶切，不同基
因序列，不同限制性内切酶酶切扩增产物，在 电泳后可产生不同电泳图谱，通过对电泳图谱 的分析，得出基因多态性结果。 思考：需要和探针做核酸杂交吗？为什么？