石质文物保护中的微生物问题

采样 1
• 灭菌器材的准备
高温灭菌：干热灭菌法（火焰灼烧、烘箱），湿热灭菌（消 毒）法（常压—巴氏消毒、煮沸消毒、间歇灭菌，加压—
常规加压灭菌、连续加压灭菌）
采样 2
根据检测的目的、技术选取方法和器材：
•镜检：接种针，碳导电胶„„ •培养：灭菌离心管、消毒棉签、接种针、培养基、封口膜
„„
•提取DNA：灭菌离心管、保温桶（含冰块/袋）、接种针„„
常条件下，微生物可能分泌柠檬酸和丙酮酸）。而这些酸类物质
就会引发生物腐蚀。
微生物对石质文物造成的影响
微生物对石质文物造成的损害 – 生物硫酸的作用
微生物对石质文物造成的影响
微生物对石质文物造成的损害 – 生物硫酸的作用
微生物对石质文物造成的影响
微生物对石质文物造成的损害
2. 盐胁迫
链霉菌
真菌：酵母菌
• 特点：
（1）个体一般以单细胞状态存在；
（2）多数出芽繁殖，也有裂殖；
（3）能发酵糖类产能； （4）细胞壁常含甘露糖； （5）喜在含糖量较高、酸度较大的水生环境生长。
直径一般是细菌的10倍。
真菌：霉菌
• 一些丝状真菌的统称，菌丝体发达而又不产生大型子实 体。 • 自然界中，各种复杂有机物，尤其是纤维素、木质素和 半纤维素的分解者。
化。其机制可被归纳为以下几类：
微生物对石质文物造成的影响
微生物对石质文物造成的损害
1. 酸蚀
微生物对矿物材料所造成的最严重的损害往往由此而成。例如， 化能无机自养型的硫杆菌属（ Thiobacilli ）微生物会将硫转化为
硫酸，如果这类微生物出现在矿物材料上，就很可能引发生物腐
蚀。同理，硝化细菌（亚硝化菌和硝化菌）会将基质中的氨转化 为亚硝酸和硝酸。并且，几乎所有微生物都会分泌有机酸（在异
（3）非细胞类：病毒、类病毒、阮病毒等。
哪里没有微生物？
万米海底热泉（缺氧、 光、超1000大气压、 100℃以上）
封冻10万年的冰川内 部3km深处
沙漠（干旱、营养匮 乏、温度变化幅度大、 紫外辐射）
红海盐滩（高盐 度）
受5000Gy辐射后的现场 （人的辐射致死量为10Gy）
金矿毒液(极酸， pH=0)
发挥显要的作用。
微生物对石质文物造成的影响
微生物对石质文物造成的损害
微生物对人造复合物（如混凝土）和天然石材均会造成影响，
二者道理相通。尽管矿物材料含有（砂岩除外。由于腐殖质沉积， 砂岩中可能含有多至 1%的有机物）非常少的可供生物代谢的有
机质，许多微生物依然能在其表面或内部生长并对其造成生物劣
容之一。
主要内容
1. 微生物学基础
2. 微生物对石质文物造成的影响
3. 石质文物微生物检测技术
4. 石质文物的微生物病害防治
病害防治
“防”重于“治”
防护原则 1
• 监控为主，定期检查，对刚刚萌芽的病变进行
及时的采样分析。
• 在对壁画施加了其他保护措施——如控制温湿 度，涂抹防护材料等后的一段时间，应加强监 测，直到微生物建立起新的平衡。
消毒剂类型 特点 例 甲醛、戊二醛、环氧乙烷、 过氧乙酸、过氧戊二酸、环 氧丙烷、含氯消毒剂、含溴 消毒剂等 含碘消毒剂、醇类消毒剂、 酚类消毒剂等
高效消毒剂
可以杀灭一切微生物，包括细 菌繁殖体，细菌芽胞，真菌， 分枝杆菌、病毒等
云冈石窟的石质文物主要是由砂岩构成，砂岩的胶结物中含有大量的 CaCO3，这些酸性物质会对云冈石窟的石质文物及周边岩石造成腐蚀。
案例总结
云冈石窟历史悠久，规模宏大，风格独特。但随着岁月的冲刷，这座举世 闻名的艺术宝库却遭受到了一定的破坏，除去物理、化学因素的影响外，微 生物侵蚀也是造成文物损坏的一个重要因素。
生命的呈现
A
Bห้องสมุดไป่ตู้
A：细胞
B：DNA的复制、转录与翻译
C：蛋白质
C
微生物 • 定义
石质文物生物病害的主要制造者
一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称。（体
长＜0.1mm）—— 不具分类意义
• 种类
（1）原核：细菌、放线菌、支原体、立克次氏体、衣原 体、蓝细菌（蓝藻）、螺旋体等。 （2）真核：真菌（酵母菌、霉菌、大型真菌）、原生动 物、显微藻类等。
地 衣
• 真菌和光合生物之间稳定而又互利的联合体，真菌是主 要成员。传统定义把地衣看作是真菌与藻类共生的特殊
低等植物。
主要内容
1. 微生物学基础
2. 微生物对石质文物造成的影响
3. 石质文物微生物检测技术
4. 石质文物的微生物病害防治
微生物对石质文物造成的影响
复杂性、多向性
1. 负面影响（主要）
不经微生物分离培养，直接从土壤中抽提总DNA ，分析其中 16S rRNA 的序 列多态性，以此反映微生物的种群构成，是近年来逐步发展起来的新方法。
该方法对于研究石质文物表面或内部的微生物群落组成具有重要意义。
随着研究的深入，人们会发现微生物对石质文物的破坏能力远远超出我们
之前的设想范畴，抑制微生物的侵蚀将成为今后石质文物保护工作的核心内
防护原则 2
• 分析造成病害的原因：
微生物与微生物 微生物与植物 微生物与动物 微生物与环境（微、宏观）
检（监）测
亡羊补牢、对症下药
病害治理
• 物理方法 • 化学方法 • 生物方法
物理方法
• 机械清除：擦、抹、冲洗、过滤等 • 热力：干热、湿热 • 辐射：电离辐射、紫外线、超声波、微波
化学方法
是一种分子生物学技术，用于放大特定的 DNA 片段。可看作生物体外的特殊
核心技术 2 ： DGGE(denaturing
gradient gel electrophoresis) ，即
变性梯度凝胶电泳，就是将特定的双链 DNA 片段在含有从低到高的线性变性 剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，随着电泳的进行， DNA 片段向高浓度变性 剂方向迁移，当它到达其变性要求的最低浓度变性剂处，双链 DNA 形成部分 解链状态，这就导致其迁移速率变慢，进而聚集成可见条带。不同生物的 DNA 具有序列特异性，因此我们可以借助 DGGE 技术分析样品中的生物群落结 构。
样品处理
• 镜检：制片、观察
• 培养：放置在培养箱培养、观察
• 提取DNA：放置在-20º C冰箱
石质文物微生物检测技术
镜检
• 普通光学显微镜
细菌：染色（普通、革兰氏、芽孢……） 真菌
• 扫描电子显微镜（SEM）
固定、干燥、喷金、20KV
光学显微镜观察示例
600×
600×
电子显微镜观察示例
石质文物表面的微生物会释放出代谢产物，再通过化学反应 转化成盐。一定湿度条件下，水分蒸发进而导致盐分析出，而这
部分盐就会沉积在材料表面或内部。例如，壁画就会被微生物以
此途径缓慢地造成损害。
微生物对石质文物造成的影响
微生物对石质文物造成的损害 – 盐胁迫 灰白色铜绿
盐性粉化
斯里兰卡 Dambulla洞穴
微生物对石质文物造成的影响
微生物对石质文物造成的损害 3. 微生物导致的石质文物变色
生物色素
氧化还原反应
微生物对石质文物造成的影响
4. 菌斑覆盖
菌体直接生长在石质文物表面，并形成可见菌斑。 细菌和真菌均可造成此类病害。
微生物对石质文物造成的影响
5. 生物绿锈
主要由光合微生物类群（例如蓝藻）造成 。 蓝藻类细菌的粘质鞘在漫长的干燥阶段对它们起着保护作用，因为 它们能够长期吸收和保存水分。 在非极端的环境中，蓝藻通常和绿藻混合生长。 根据不同的生理状态，藻类产生不同颜色的生物绿锈，以绿色为主。 生物绿锈主要由微生物构成，同时也会粘附灰尘、肥土等。
检测结果
云冈石窟38号窟样品中含有假单胞菌属、微杆菌属及其他未培养微生物。 根据系统发育树聚类分析，可以得出检测出的微生物主要分为四大类群 : γ-变 形菌纲(Gamma-proteobacteria) ，鞘脂杆菌门(Sphingobacteria) ，α-变形菌 纲(Alpha-proteobacter)和放线菌纲( Actinobacteria) 。
例：生物劣化（腐蚀、降解、变色 等）。
2. 正面影响（次要）
例：某些细菌引发的生物矿化，可能起到 保护作用。
微生物对石质文物造成的影响 — 生物劣化
大多微生物类群微生物（如自养型细菌、异养型细菌、蓝藻、真菌、 地衣）都可能会在矿物材料表面或内部定居生长，而这些矿物材料的 种类包括天然石材、人工混凝土、陶瓷以及玻璃等。就石质文物而言， 这就会导致造成一定的危害，即生物劣化。 微生物的对石材的侵蚀或徐或急，程度不一。其中，相对强烈的生 物劣化多为生物产酸（有机酸）造成；相对和缓的生物劣化则多由亲 水性物质（如杂多糖和/或蛋白质）所造成，原因是这些物质会引发水 和盐在矿物上的积累。相较而言，微生物胞外酶在劣化过程中并没有
• 大小：直径 50nm - 50μm
• 形态：球状、杆状、螺旋状。
双 球 菌
细菌 -
球菌
四 联 球 菌
除单球菌外还有：
八 叠 球 菌
葡 萄 球 菌
链球菌
细菌 梭 状 杆 菌
杆菌
形状多样，最为常见
棒 杆 菌
分枝杆菌
细菌–
弧 菌
螺旋菌
螺 菌
螺旋体
放线菌、蓝藻（蓝细菌） 也属于细菌
瘦 鞘 丝 藻
检测目的：通过对云冈石窟石质文物表面及云冈石窟周边岩石样品中微
生物的研究，建立可用于快速检测石质文物中微生物的方法。
材料：云冈石窟38窟及其周边土壤
方法：样品采集
→ 总DNA的提取 → PCR-DGGE分析
核心技术 1：聚合酶链式反应(Polymerase
DNA复制。
Chain Reaction)，简称PCR，
38号窟样品DGGE切胶条带的系统发育树
检测结果显示，云冈石窟38号窟样品中的假单胞菌属细菌 ( Pseudomonas) 占到种群的16. 19%，可以被认为是样品中的优势种群。
在微生物与岩石土壤作用的相关研究中，发现该属细菌有较强的解磷作用， 即将植物等难以利用的含磷成分转变为可以利用的磷盐形式，特别是以溶解 不溶性磷酸盐类为特征的无机解磷作用。此外，该属的部分种类在氮元素循 环中也扮演着重要角色。调查研究发现，云冈石窟的周边环境中含有高浓度 的含磷、硫、氨的大气污染物质，该属的细菌可将这些物质降解并进而一步 产生酸性物质。
石质文物保护中的微生物问题
南开大学微生物系 潘皎 2013 - 5 - 13
主要内容
1. 微生物学基础
2. 微生物对石质文物造成的影响 3. 石质文物微生物检测技术
4. 石质文物的微生物病害防治
生 物
有生命的个体。最重要和基本的特征在于进行新陈
代谢及遗传。 自然界是由生物和非生物的物质和能量组成的。有 生命特征的有机体叫做生物，无生命的包括物质和能量 叫做非生物。
微生物对石质文物造成的影响
微生物对石质文物造成的损害 – 生物绿锈
主要内容
1. 微生物学基础
2. 微生物对石质文物造成的影响
3. 石质文物微生物检测技术
4. 石质文物的微生物病害防治
检测目的
• 确定微生物病害 • 确定最主要的致病微生物
• 鉴定致病微生物及群落中其他主要菌群种属
• 为规范的微生物防治工作奠定基础
石质文物微生物检测技术
1. 传统培养法
分离和纯培养、生理生化反应
2. 分子检测技术
DNA指纹印迹分析
分子技术 Vs. 传统技术
• 分子生物学技术是有效的检测手段；若要深入
研究病理、加以防治，仍需传统技术。 • 传统技术宜为分子生物学技术的补充。
在文物微生物检测中，应优先使用免培养分子生物学技 术，在其检测结果的基础上，有针对性地采用传统技
术分离培养有研究价值的特定微生物。
石质文物微生物检测案例 云冈石窟
背景：云冈石窟是我国最大的石窟之一，与敦煌莫高窟、洛阳龙门石窟和
麦积山石窟并称为中国四大石窟艺术宝库。 位于山西省大同市以西 16 公里 处的武周山南麓，依山而凿，东西绵延约一公里，气势恢弘，内容丰富。现 存主要洞窟 45个，大小窟龛 252 个，造像 5万1 千余尊，代表了公元 5 至6 世纪 时中国杰出的佛教石窟艺术。其中的昙曜五窟，布局设计严谨统一，是中国 佛教艺术第一个巅峰时期的经典杰作。
微生物的适应性令人生畏
Pyrodictium abyssi
Herminiimonas glaciei
Deinococcus peraridilitoris
Haloquadratum walsbyi
Halobacterium NRC-1
Ferroplasma acidophilum
细 菌
• 细胞细而短、结构简单、细胞壁坚韧，以二等分 裂方式繁殖和水生性较强的原核微生物。