糖化血红蛋白方法学

一：血红蛋白的命名

HbA (α2β2 ): 又称主要成人血红蛋白，有2条α链和2条β链构成的四聚体；

HbA1: 专指由离子交换色谱和电泳法所分离出来的糖化血红蛋白中带负电荷增加的HbA组分被称为HbA1，包括HbA1a, HbA1b, and HbA1c; 也被称为快速糖化血红蛋白；

HbA1c: 葡萄糖与血红蛋白β链氨基酸末端缬氨酸残基结合产生的一种特定的糖化血红蛋白；

Total GHb: 专指由亲和层析色谱方法所分离出来的所有糖化成分被称为总糖化血红蛋白。

HbF(α2γ2)：胎儿血红蛋白的最主要成分，新生儿血中占70-80%；于生后6个月到2年后即可降至成人的正常浓度<1%

HbA2（α2γ2）:又称次要成人血红蛋白,升高提示地中海贫血

二：HbA1c的形成

血红蛋白葡萄糖中间产物-LA1c HbA1c

三：HbA1c 的重要性

1.糖尿病是一种慢性病，它可引发多种慢性并发症，如心脏、血管、眼睛、肾脏及神经系统等一系列病症

2.DCCT （糖尿病控制与并发症关系实验）研究显示严格控制血糖可降低这些慢性并发症的发生和发展的程度；该实验中血糖控制好坏以糖化血红蛋白HbA1c 为评价指标。

3.DCCT 实验最先确定了糖化血红蛋白HbA1c 在评价血糖控制指标中的重要地位，现在所有的NGSP 方法均要求溯源到DCCT 。

4.糖化血红蛋白 (HbA1c) 是糖尿病人管理的一个重要的指标，但是迄今为止尚无一个被所有组织所承认的HbA1c 检测的国际标准。

三个月平均血糖水平（mmol/L ）

HbA1c 与三个月平均血糖水平成正比

MBG (mg/dl) = 35.6 x (%A1c) – 77.3 (Diabetes care 2002; 25:275-278)

H b A 1c (%)

四：A1c是一个要求高精密度的实验项目

非糖尿病5% CV 糖尿病6.46% 6.80% 7.14%

低平均高

五：HbA1c 检测方法介绍

目前, 已在中国注册使用的HbA1c检测仪器大约来自十几个厂家根据检测原理的不同主要分为三种方法

(1) 根据电荷携带的不同

小柱法

琼脂糖电泳

离子交换层析/HPLC

(2) 根据结构的不同

亲和层析/HPLC

免疫分析

各检测糖化血红蛋白方法的精密度

方法精密度

小柱法+

电泳法+

免疫分析++

LPLC +++

HPLC* +++++

→HPLC法为国际推荐参考方法

六：检测方法优缺点对比分析

电泳法

1.胶体颗粒在一定条件下可以带有电荷，带有电荷的胶体颗粒可以

借静电吸引力在电场中泳行，带正电荷者泳向负极，带负电荷者泳向正极，此种现象称为电泳。

2.血清中各种蛋白质都有它特有的等电点，各种蛋白质在各自的等

电点时呈中性状态，它的分子所带正电荷与所带负电荷量相等。电泳法的局限性

1.需成批进行样本分析，速度比较慢，无法进行实时检测

2.自动化程度低，急诊插入、自动维护等功能比较欠缺。

3.重复性差

4.目前已经很少有实验室使用

亲和色谱法

1.糖化血红蛋白分子表面含葡萄糖的1,2-cis diol（顺式二糖醇），该

基团可与分析柱固定相上的硼酸基团成特异和可逆的结合；

2.根据亲和色谱的分离原理，所分离的产物不仅包括β链氨基酸末

端的糖化成分，也包括α链氨基酸末端和所有血红蛋白分子ε残基的糖化成分，其最终结果应为总糖化血红蛋白；

3.总糖化血红蛋白结果需要通过校准品的校正后以HbA1c结果报

告给客户，以使结果能够溯源到DCCT。

免疫法

1.使用单克隆或多克隆抗体直接测定血红蛋白β-链上糖基化的N

末端的4-8个氨基酸，从原理上来说对HbA1c上的糖基特异性好。

2.由于血红蛋白变异体的普遍存在，对免疫法的准确性及重复性造

成挑战

3.生化仪上使用的免疫分析法一般需要占用两个分析通道，一个通道检测总血红蛋白，一个通道检测糖化血红蛋白（一般也为免疫比浊法），通常需要4-5个定标液。

免疫法的局限性

1.免疫法是目前用来测试HbA1c值最常用的方法（65%）

2.使用的单克隆或多克隆抗体可以识别血红蛋白β-链上N末端糖

基化的前4-10个氨基酸，但这些抗体不能识别可逆的希夫碱或其它的GHb族。

3.任何能导致Hb β链N末端前4-10个氨基酸改变的变异体都会在使用这些抗体进行测试时带来错误结果。

4.比较差的精密度：CAP调查中一般CV%在5%左右，但是由于

生化试剂需要单独购买较贵的校正品（5-6个浓度），因此国内的客户校正频率一般满足不了糖化测试的要求；卫生部临检中心的糖化室间质评调查中，生化法的CV%>10%

5.虽然免疫法给临床实验室带来低成本和自动化的优势，但这种方法显而易见的问题是无法区别病人体内所有的血红蛋白变异体。

离子交换HPLC

1.离子交换HPLC（ high-performance liquid chromatography ）

系统是第一个检测HbA1c的全自动仪器

2.离子交换HPLC的分离原理是：血红蛋白（Hb）与葡萄糖结合后带负电荷增加（即正电荷减少），并且不同部位或不同糖成分的糖化结合，带电荷数有差别，如负电荷数HbA1a> HbA1b > HbA1c；分析柱的填充物作为固定相，偶联的基团在一定的pH值下带负电荷；HbA1a、HbA1b、 HbA1c与分析柱的结合力最低，故先于A0依次被洗脱下来。

离子交换HPLC的特点

1.结果准确，可靠

分析物为HbA1c。

除可测定HbA1c外，还可同时检测出常见血红蛋白变异体，并且在计算HbA1c值时会自动扣除变异体产生的影响

2. 重复性好

CV<3% （NGSP Level 1认证实验室要求）