菌种分离筛选分解

第二节 分离样本的采样
1、采样对象 以采集土壤为主。 • 一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细 菌和放线菌为主；富含碳水化合物的土 壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一 些野果生长区和果园内。 • 采样的对象也可以是植物，腐败物品， 某些水域等。
从自然界筛选
• 2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。 • 3、采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去 表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的 牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时 间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样 中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步 分批寄回，以便及时分离。
菌种筛选主要步骤
• 调查研究及查阅充分的资料 ↓ 设计实验方案 ↓确定采集样品的生态环境 采样 ↓确定特定的增殖条件 增殖培养 ↓确定特殊的选择培养基及可能的 ↓定性或半定量快速检出法 平板分离 ↓
• 原种斜面 ↓确定发酵培养基础条件 筛选 ↓ 初筛（1株1瓶） ↓ 复筛（1株3～5瓶） ↓结合初步工艺条件摸索 再复筛（1株3～5瓶） ↓ 3～5株 ↓ 单株纯种分离 ↓ 生产性能试验 ↓→毒性试验 菌种鉴定
5．列出生物系统中有用的自然底物，如森林土 壤中的几丁质、葡萄表皮的果胶； 6．根据上述1-5项中所获得的数据，设计分离方 法，即选择适宜的稀释液、底物、试样、天然浸 出汁和培养条件； 7．用标准方法作对照来评价生态学分离方法； 8．根据待检材料的生态参数需要，修改已知的 方法； 9．运用特定的富集方法，富集那些可能具有筛 选意义的微生物类群。
一、成功的分离培养方法
(1)认真考察所需产品的特征和生产过程； (2)制订初步的筛选标准；
(3)将生态学方法运用到分离和筛选过程。
三、将生态学方法用于培养分离 的一般思路要点
• 1．罗列出所要分离的微生物类群； • 2 ．根据所采集样本的各种生态参数，描述所要 分离的微生物之生态系统或栖息地： • 3 ．将若干样本分成若干类型，如植物和植物各 部，土壤 ( 类型和土层 ) 、岩石、水、昆虫和发酵 食品等； • 4 ．罗列出所要考察和测量的环境参数，如 pH 、 盐分、水分、氧化还原电势及温度等；
培养分离
• 从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要 和基础的步骤。 • 到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示 一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。 • 在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种 类的菌株；在工业微生物筛选过程中，应及时调 整检测方法，以与各种不同类型的生长和代谢之 微生物相适应。 • 因此，建立一更为科学的和针对性不强的分离方 法是必要的。
（四）筛
•
选
这一步是采用与生 产相近的培养基和培 养条件，通过三角瓶 的容量进行小型发酵 试验，以求得适合于 工业生产用菌种。
（五）毒性试验
• 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的， 将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品 工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定， 微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米 曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外， 其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒 性试验。
三、新种分离与筛选的步骤
• 定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生 长培养特性。 • 采样：有针对性地采集样品。 • 增殖：人为地通过控制养分或培养条件，使所 需菌种增殖培养后，在数量上占优势。 • 分离：利用分离技术得到纯种。 • 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性 包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特 性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温 度、生长和发酵最适温度、最适pH 值、提取工 艺等。
四、自然界中细菌的分离
(一)采样和采集方法
• 为了从一特定生态系统中分离出具有代表性的 细菌菌群，特别是分离那些在唯一微环境区域 中出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。 • 样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样 采集器、镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋 和塑料瓶等。
• 二、控制培养条件 pH值的控制 细菌、放线菌：pH 7.0～7.5 酵母菌、真菌：pH 6.5～7.0
温度的控制
通气量的控制
• 三 抑制不需要的菌类 如使用不同类型的抗生素、高温、 高压等条件，抑制不需要的菌类。
第四节 微生物的培养分离
•
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微 生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。 在这—步，增殖培养的选择性控制条件还应进 一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种 分离的方法有划线分离法、稀释分离法。
第六章 微生物菌种的分离筛选
第一节 菌种分离的总体设计
第二节 分离样本的采样
第三节 含微生物样品的富集培养 第四节 微生物的培养分离
第一节 菌种的分离简介
一、菌种的来源
• 根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂 或菌种保藏部门索取或购买； • 从大自然中分离筛选新的微生物菌种。
二、分离思路
• 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照 生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法， 快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。 • 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必 须重新进行分离纯化。 • 有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合 理先进的设备与之配合。
1. 稀释平皿分离法 1. 稀释平皿分离法
(1)稀
释
1ml
1ml
1ml
1ml
1ml
1g
100ml 1/100
9ml
9ml
9ml
9ml
9ml
9ml
1/1000 10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
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1.稀释平皿分离法
a.倾注平皿分离法
b.涂布平皿分离法
2.平皿划线分离法 a. 连续划线分离法
b. 分区划线分离法
• 二 根据微生物生理特点采样 1、根据微生物营养类型
2、根据微生物生理特性
• 三 特殊环境下采样
第三节 含微生物样品的富集培养
• 为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物 至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择性 培养基，选择一定的培养条件来控制。 一、控制培养基的成分 • 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维 素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那 么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长， 而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段 的纯种分离就会顺利得多。