第二节 石蜡切片制作

切片方法


切片前，选择刀口平整无缺刻的部分来进行切削。 将所要切的包埋块固定在标本台上，使包埋块外切 面与标本夹截面平行，并让包埋块稍露出一截。将 刀台推至外缘后松开刀片夹的螺旋，上好刀片，使 切片刀平面与组织切面间呈15°左右的夹角，包埋 块上下边与刀口平行。在微动装置上调节切片要求 的厚度，调节时应注意指针不可在两个刻度之间， 否则容易损伤切片机，将刀台移至近标本台处，让 刀口与组织切面稍稍接触，这时就可以开始切片了。 方法是：右手转动转轮，左手持毛笔在刀口稍下端 接隹切好的片子，并托住切下的蜡带，待蜡带形成 一定长度后，右手停止转动，持另一枝毛笔轻轻将 蜡带挑起，平放于衬有黑纸的纸盒内，注意切片速 度不宜太快，摇动转轮用力应均匀，防止切片机震 动厉害引起切片厚薄不均匀，还应注意转动的方向， 以防标本台后移而切不到片子。切片完毕，应及时 用氯仿将切片机的有关部分擦净。
实验室切片机结构
切片机和切片刀

切片机是用来作各种组织切片的一种专门设计的精 密机械，常用的是旋转式切片机，它的夹物部分是 上下移动前后推进的，而夹刀部分则固定不动。主 要部件是安装切片刀的刀台、安装包埋块的标本台 和控制切片厚度的微动装置。切片时切片刀固定不 动，转动转轮，标本台上下运动并按调好的切片厚 度向前推进一定的距离，组织块上下运动一次，便 在刀片上得到一张合乎厚度要求的切片。

伊红溶液的配制
1.伊红酒精溶液的配制： 伊红Y（0.5-1.0g）+95%无水乙醇（100ml）， 过滤。混合即可使用。

2.伊红水溶液的配制： 伊红Y（0.5-1.0g）+100ml蒸馏水，溶解至溶 液中无伊红沉淀，过滤即可使用。

0.5%~1%盐酸酒精溶液的配制

浓盐酸（0.5~1ml）+70%~90%酒精溶液 100ml，混合均匀即可。 注意事项：因为浓盐酸对皮肤具有强烈的腐 蚀作用及对呼吸道具有刺激作用，因此在配 置的过程中一定要注意自身的安全。


解决办法：
1．旋紧螺旋； 2．可放平1—2°后再切； 3．用氯仿拭去。

问题七：切片厚薄不匀

原 因：
1．切片机有毛病； 2．夹刀不当； 3．未旋紧标本台螺旋; 4．石蜡块过硬;

解

决办法：
1．矫正切片机装置； 2．对症治疗； 3．旋紧螺旋； 4．将石蜡块在水中浸泡。



不同浓度梯度酒精配制
梯度酒精的作用： 将组织中的水分经过梯度酒精的作用，置换出 来，以达到组织脱水的目的。
配制：例如70%的酒精配制，70ml（100%纯 酒精）+30ml蒸馏水混匀即可。
石蜡切片所需的实验器材

仪器：石蜡切片机、恒温蜡箱、载玻片、盖 玻片、镊子、手术刀。 材料：小鼠的组织（小鼠肝脏）。 试剂：乙醚、无水乙醇、甲醛、冰醋酸、苦 味酸、、锇酸、正丁醇、二甲苯、石蜡、甘 油、中性树胶。
原
因：
1．刀有缺口； 2．石蜡块中含有颗粒、杂质； 3．刀口留有碎屑或细丝； 4．组织太硬。

解
决办法：
1．可移动刀口； 2．将颗粒拽去； 3．清洁刀口； 4．让包埋块在水中浸泡。

问题六：切片有横纹
原
因：
1．刀和台木的固定螺丝太松； 2．刀口倾斜度太大； 3．刀口有石蜡屑。
第四步：浸蜡包埋
由二甲苯透明的组织块经过二甲苯+石蜡
后，即可进入纯蜡中，一般浸蜡在温箱 中进行，温度稍高于石蜡的温度，蜡质 由于冬夏的温度不同而进行选择。 注意：熔蜡及浸蜡温度保持在65℃左右。 经过浸蜡之后的组织，必须包埋好才能 切片。
第六步：切片
切片之前必须修整好蜡块，并且固定在木块 之上，再将四周多余的残蜡用刀片削去，否 则不易于切片和展片。 切片使用旋转切片机时，应固定好木块；调 整好切片刀与蜡块的距离与角度，一般刀的 倾斜度为4-6度；根据切片的厚度不同调节厚 度标志器，在操作的过程中还应注意自身

解
决办法：
1．在切片机上方开一电灯或提高室温； 2．在蜡块面加一层； 45℃的软蜡或用手指蜡摩擦块面； 3．重新包埋； 4．矫正刀的角度。

问题三：切片卷起呈圆筒状

原 因：
1．室温过低； 2．石蜡过硬； 3．刀口太钝； 4．刀的倾角太大。

解

决办法：
1．提高室温； 2．加软蜡； 3. 用毛笔将蜡片摊开压住，切2—3 片即成 带； 4．减小倾角。
第三步：冲洗、脱水、透明。

冲洗的目的在于弃去组织中过剩的固定剂，以免固 定剂沉淀于组织之中影响切片的质量。 脱水的过程就是用梯度酒精逐步取代水的过程，组

织脱水一般由70%——80%——90%—— 95%——100%梯度酒精完成。在95%的时间可

以稍长（注意：70%以上的酒精要回收利用）。 脱水之后，将组织块放入100%的酒精+二甲苯溶液 （1：1）再放入二甲苯溶液直到组织块透明为止， 透明需要半小时到一小时左右。
封片的注意事项
带有组织的载玻片，由二甲苯中取出，使用 纱布或者滤纸迅速擦净多余的二甲苯，然后 在组织切片上滴上一滴中性树胶轻轻的使用 镊子夹取盖玻片盖在组织上面，轻轻压一下 盖玻片（目的防止气泡的产生）。
第十步：显微镜下观察HE染色的结果
在显微镜下观察到细胞核呈蓝紫色，细胞质、 胶原纤维、肌纤维呈粉红色。 注意：根据不同的染色要求，苏木精染液可 以稀释，加长染色时间，效果较好。伊红染 液也可以相应的稀释，防止粉红色过深，影 响细胞核与细胞质颜色的对比，尤其不利于 黑白片显微系统的拍照。
解
决办法：
1．取下台木，将两边修干；
2．调节标本台，使两者平行； 3．移动刀片，改用新的刀口； 4．待蜡块冷却后再切，或重新包埋； 5．用刀片切去部分石蜡，使材料居中； 6．在大的一边切去少许石蜡。
问题二：切片分离、不能连成带状
原
因：
1．室温过低； 2．石蜡过硬； 3．材料边缘留蜡太少； 4．刀的角度不适合。
1：能迅速使蛋白质变性，使细胞维持原来的形态，既 不收缩又不变形。 2：固定剂必须也是保存剂，使组织在其中不易腐烂。 3：固定剂应有较强的通透能力，以保证组织块的内部 也能被及时的固定。 4：固定后的组织应软硬适宜，便于切片。 5:固定后的组织应容易被染料着色。 ！注意:不同固定剂固定时间不一样。具体问题具体分 析。
石蜡切片的制作
简介：
石蜡切片是教学与研究工作中广泛运用的一 种实验技术，特别对于细胞学、组织学、胚 胎学、病理学，更是一种必备的研究方法。 对于不同的显微镜具体的制作切片的技术也 是不同的！ 现在以苏木精、伊红染色的常规制片为例 作具体讲解！

整个石蜡切片的完成过程
各种药品的配制及器材准备
问题四：切片粘附于切片刀，皱摺在一起
原
因：
1．室温过高； 2．石蜡过软； 3．刀口上留有一层石蜡； 4．刀口钝。

解
决办法：
1．降低室温； 2．将蜡块投入凉水中稍浸增加硬度； 3．切片厚度，改用硬蜡包埋，用二甲苯拭去 刀口的石蜡； 4．磨刀或移动刀口。
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问题五：切片纵裂
80%的酒精
70%的酒精
90%酒精
0.5%的盐酸水分色数秒钟在显 微镜 下检查退之前红色
100%酒精（1）
自来水冲洗（ 蓝化）
100%酒精（2）
蒸馏水冲洗 0.5%伊红（95%酒精溶液）数秒钟
二甲苯+100%酒精（1：1）
二甲苯（1） 二甲苯（2）
70%酒精
80%酒精
树胶封片
第八步：透明
染色后的切片须再次经过脱水、透明。 标本经二甲苯透明后，折射率改变，透明度 提高，使得染上色的部位更清晰地显示出来。

切片中存在的问题及补救方法
石蜡切片是很不容易掌握的，有时很容
易成功，有时则由于某种因素而造成切 片的质量低劣，甚至完全失败。现将切 片时经常遇到的一些缺点、可能的原因 以及补救办法。
问题一：石蜡带弯曲不直

原 因：
1．石蜡块上下两边不平行； 2．石蜡块的上下两边不和刀口平行； 3．刀口锋利不一，局部产生差异； 4．蜡块的一边较另一边为软，或两边的硬度 不一致； 5．材料未居蜡块正中央； 6．材料大而形不正。
石蜡切片展片
一般使用恒温水浴锅，温度控制在37-40℃左 右，有利于石蜡切片的展开。 待石蜡切片切片完全展开之后，即可用载玻 片进行捞片。 捞片手势切忌粗暴。一定要亲柔。防止两张 切片粘黏在一起。

石蜡切片的烘烤
目的：使石蜡切片与载玻片粘黏更加紧密， 防止在进行染色的过程中，组织片与载玻片 分离开来，造成掉片。 烘烤的温度及时间：使用恒温烤箱进行烤片， 温度一般控制在38℃左右，时间一般控制在 12h或者在恒温箱中过夜处理即可。

第九步：封藏
封藏的目的： 是使制成的切片能够永久保存，封藏剂必须能与透明剂互溶， 对染色无影响，折射率近似玻璃和具有粘性的物质，常用的 封藏剂有加拿大树胶和中性树胶。
封片的方法是： 将载玻片从二甲苯中吸出后，吸去多余的二甲苯，在标本上 的二甲苯尚未干透之前加一滴树胶，仔细覆盖上盖玻片，避 免产生气泡，也不得拖动盖玻片，以免将标本破坏。树胶量 视盖玻片大小而定，勿使过多过少。贴上标签，注明材料、 染色法，待封藏剂凝固后便成为一张成功的石蜡切片。

固定液的配置

10%福尔马林（甲醛）溶液：100ml甲醛溶液+900ml蒸馏水。 10%缓冲中性福尔马林（甲醛）溶液：100ml甲醛溶液 +900ml蒸馏水+4g磷酸二氢钠+6.5g磷酸氢二钠。 10%中性福尔马林（甲醛）溶液：100ml甲醛+900ml水+碳 酸钙加至饱和充分振荡混合后，放置24小时取上清液使用。 4%多聚甲醛-磷酸盐缓冲液：4g多聚甲醛+100ml磷酸盐缓冲 液（适用于免疫组化学技术）。


第一步：取材

一般根据观察目的选取动物 或人体组织，取材要迅速，
组织块不宜太大，一般 为组织学观察，取黄豆 大小为宜。取材要用锋利
的刀剪，不可用钝刀，更
不可用力压、揉、挤等，
以免损坏组织。
第二步：固定
无论何种器官、组织，要制成切片，首先需要固定。目 的在于保存组织原有的形态，同时使之易于染色。固定要求：

的安全。
石蜡块的固着与整修

在包埋以后，就可进行切片。包埋好的石蜡块装上 切片机进行切片前还须进行固着和整修。 固着：一般旋转式切片机上都附有可固着石蜡块的 金属小盘，这也可用同样大小的台木替代。用加热 的蜡铲将包埋块粘贴于固着物上，并使组织块朝外， 便于以后迅速切出所需的片子。整修：用加热的蜡 铲或刀片将固着的包埋块四周修平，使上下两面修 成平行面，常保留组织周围附着宽2～3mm的石蜡， 而修好的蜡块呈长方形。还可削去一角以便于在蜡 带上识别切片。

第七步：染色
在染色的操作中：最常用的为
HE染色 法。染色前必须准备好洁净的染色缸。 并分别放入二甲苯、各种浓度的酒精及 染料中进行染色。 不同组织的染色时间不同。
蒸馏水 切片、展片及烤片 苏木精染色 二甲苯（1）脱蜡 二甲苯（2） 100%的酒精 95%的酒精
自来水洗（在显微镜下检查细胞核的颜色是否 合适，若太浅，可经蒸馏水洗后放回重染， 若过深则进行适当分化。）
问题八：每张切片厚薄不匀
原
因：

1．刀口震动，是由于材料过硬；

2．刀的倾角太大。

解决办法：

1．在蜡块表面涂一层火棉胶；
2．减小倾角。

问题九：材料发生裂隙破碎或脱落
原

因：
1．脱水不干净； 2．有透明剂残留； 3．石蜡透入时，温度过高或时间过长； 4．由于脱水剂和透明剂的影响，使组织变硬 发脆； 5．材料太硬或太粗。
染色液的配制 固定液的配制 梯度酒精的配制 采样器材的准备
染色液的配制
Ehrlich氏苏木精 苏木精：2g; 无水乙醇：100ml； 冰醋酸：10ml； 铝化钾或硫酸铝钾：10g； 蒸馏水：100ml； 甘油：100ml。

配制方法： 1.将铝化钾或硫酸铝钾溶于蒸馏水中（加热 至40~45℃）； 2.将苏木精溶于无水乙醇中，再加入冰乙酸、 温热的铝化钾或硫酸铝钾溶液，最后加入甘 油； 3.配置完成后，置于温热和阳光充足处，成 熟3个月，即可使用。