转基因原理

4、对筛选剂敏感；
5、转化率高
叶盘法
双子叶植物较为常用、简单有效的方法。
农杆菌共培养侵染 诱导愈伤组织 分化生芽
叶盘转化法
Biblioteka Baidu
生根
拟南芥Flor-dip 转化
At4g39280.1 gene transformed into Columbia
At4g39280.1 gene transformed into AMP-GFP plant
转化大肠杆菌 提取质粒 限制酶切/连接 克隆到植物表达载体
转化农杆菌
基因枪转化
• 农杆菌: used extensively for genetic engineering of plants. • 包含Ti质粒 Tumor inducing plasmid (bacterial plasmid) • T-DNA (TransferredDNA), 可以转移进入植 物基因组.
转化体的鉴定 通过筛选得到的再生植株初步证明标记基因整合进入受体 细胞。至于目的基因是否整合到受体核基因组、是否表达， 还必须对抗性植株进一步检测。
(1)DNA水平的鉴定；（2）RNA转录水平检测；（3）蛋白质 表达；（4）表型鉴定
Tumor induced by A. tumefaciens
Ti Plasmid
T-DNA region
已知农杆菌附着到 植物细胞后，只留
auxin
Left border Right border
在细胞间隙中。TDNA首先在细菌中被 加工、剪切、复制， 然后转入植物细胞。
vir genes
ori
⑤Ti质粒上还存在一些对于T-DNA转移不起任何作用的基因。
双元载体系统:binary Ti vector system
植物表达载体转入农杆菌受体菌 农杆菌感受态制作：与大肠杆菌制作类似。
转化：液氮冻融法、电激法
植物转化：农杆菌需要在28度培养2天。低温冰箱保存菌在相应平板划线→2天
后单菌落液体培养→2天后按1:100比例扩大培养到OD600 0.5-0.8 →室温
以NPTⅡ为筛选标记基因的番茄雄性不育转基因植 株的获得
转基因植株离体叶片抗除草剂Basta的检测
受体材料的选择
受体是指用于接受外源DNA的转化材料。
良好的植物基因转化受体系统应满足如下条件： 1、高效稳定的再生能力； 2、受体材料要有较高的遗传稳定性； 3、外植体来源方便，如胚和其它器官等；
4000rpm离心收菌→MS悬浮→预培养外植体浸泡（时间因不同材料有差异） → 暗培养2天（不加选择，加抑菌抗生素Carb或Cef） →选择培养基上筛选。
转化体的筛选和鉴定 1.转化体的筛选 外源目的基因转化频率低，目的基因已被整合到核基因组并表达 转化细胞更少 使用特异性选择标记基因（selectable marker genes）进行标 记，有效地选择出真正转化细胞。 常用选择标记基因： 抗生素抗性基因 除草剂抗性基因 将选择标记基因与适当启动子构成嵌合基因，克隆到质粒载体上， 与目的基因同时进行转化。 标记基因在受体细胞表达，使转化细胞具有抵抗相应抗生素或除 草剂的能力而存活下来。非转化细胞则被抑制、杀死。
植物转基因原理
目的基因重组质粒的构建
中间质粒：pBR322、pUC,pBluescript SK、pGEM-T 植物转化载体: pBI121, pCAMBIA 系列
大肠杆菌寄主：DH5α,XL-Blue, JM109, TOP10 等
农杆菌寄主：LBA4404,EH105等
分离基因
克隆到某中间载体
野生型Ti质粒直接作为植物基因工程载体，存在如下障碍：
①Ti质粒分子量过大，一般在160～240kb，比pBR322质粒大50倍左右；
②大型的野生Ti质粒上分布着各种限制酶的多个切点，不方便插入外源基因；
③T-DNA区内含有许多编码基因，产物干扰宿主植物中内源激素的平衡，转 化细胞长成肿瘤，阻碍细胞的分化和植株的再生； ④Ti质粒不能在大肠杆菌中复制, 即使得到重组质粒，也只能在农杆菌中进 行扩增；