微生物肥料高效解磷菌筛选及解磷机理探究

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微生物肥料高效解磷菌筛选及解磷机理探究
， ２ 任友花１，王羿超１，李㊀娜１，李㊀雪２，殷海松３，乔长晟１
（ １ ． 天津科技大学天津市工业微生物重点实验室 ／ 工业发酵微生物教育部重点实验室， 天津 ３ ０ ０ ４ ５ ７ ； ２ ． 天津北洋百川生物技术有限公司， 天津 ３ ０ ０ ４ ５ ７ ； ３ ． 天津市现代职业技术学院， 天津 ３ ０ ０ ３ ５ ０ ）
㊀㊀磷在农业中起到重要作用， 土壤有效磷的缺乏导致植物
１ － ２ ］ 。磷肥的施用能够促进各种代谢正常进行， 植物生 减产 ［
中的有机酸与溶磷量的关系进行了探索， 为该菌株在微生物 肥料中的应用提供理论依据。 １ ㊀材料与方法 １ ． １ ㊀试验主要仪器（ 表１ ） 和主要试剂 衍生化试剂： 甲氧基铵盐酸盐 ／ 吡啶溶液（ 色谱纯， Ｆ ｌ ｕ ｋ ａ 公司） ， 色 谱 纯 Ｎ －甲 基 －Ｎ －（ 三 甲 基 硅 烷） 三氟乙酰胺 （ Ｍ Ｓ Ｔ Ｆ Ａ ） ， （ 购自 Ｆ ｌ ｕ ｋ ａ 公司） ； 色谱纯吡啶（ 纯度： ９ ９ ． ８ ％） ， 购自美国 Ｓ ｉ ｇ ｍ ａ 公司。试验用水为 Ｍ ｉ ｌ ｌ ｉ － Ｑ超纯水。葡萄糖 酸、 乙酸、 柠檬酸等标准样品， 分析纯。
表１ ㊀主要试验仪器 仪器名称 数显 ｐ Ｈ计 紫外可见分光光度计 高效液相色谱 气相 － 质谱联用仪 电子天平 摇床 型号 Ｆ Ｅ ２ ０ ７ ５ ２ ６ ９ ８ ０ Ｓ Ｃ ６ ０ １ ０ 生产厂商 北京汇中顺成科技有限责任公司 天津市拓普仪器有限公司 Ａ ｇ ｉ ｌ ｅ ｎ ｔ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｅ ｓ 梅特勒 －托 利 多 常 州 衡 器 有 限 公司
巨大芽孢杆菌进行紫外诱变， 其解磷能力达到 １ ６ ． ８ ５ｍ ｇ ／ ｍ Ｌ ，
７ ］ １ ７ ． ７ ％［ 。 比出发菌株提高了 １
Ａ ｇ ｉ ｌ ｅ ｎ ｔ １ １ ０ ０Ａ ｇ ｉ ｌ ｅ ｎ ｔ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｅ ｓ
微生物溶解无机磷的机理复杂， 研究认为， 一些微生物解 磷主要是其分泌质子的溶解作用， 另一些猜测认为是小分子 有机酸的酸溶和螯合作用。虞伟斌等研究表明， 有机酸的螯
紫外线是一种使用最早、 沿用最久、 应用广泛、 效果明显 的物理诱变剂。尽管几十年来， 不断有各种新的诱变剂出现 和应用于诱变育种， 但到目前为止， 经诱变处理后得到的微生 ０ ％左右是通过紫外线诱变后筛选获得 物肥料高产菌中， 有８ 的。紫外线迄今仍然是微生物育种中最常用和有效的诱变剂
５ － ６ ］ 之一 ［ 。卢金珍等研究表明， 采用蒙金娜有机磷培养基对
㊀㊀摘要： 芽孢杆菌已被广泛应用于微生物肥料的生产。以巨大芽孢杆菌 １ １ ４ ３ ３作为出发菌株， 对其进行紫外诱变， 根据平板解磷圈直径与菌落直径比值进行初筛， 再根据解磷能力进行复筛， 并最终获得一株高效解磷菌。该菌株的摇 瓶试验结果表明， 发酵 ３ｄ 后， ｐ Ｈ值从 ７ ． ０ ０降到了 ４ ． ０ ３ ， 其解磷含量可达到 ４ ６ ． ７ ９μ ｇ ／ ｍ Ｌ ， 较出发菌株 １ １ ４ ３ ３的产量 提高了 １ １ ５ ． ６ ２ ％， 且其遗传稳定性良好。以得到的高产菌 １ １ ４ ３ ３－ Ｄ作为研究对象， 对其解磷机理进行分析。发现有 Ｈ值降低。气相色谱质谱和高效液相色谱检测发现， 巨大芽孢杆菌发 机酸的产生促进了解磷量的提高且使发酵液 ｐ 酵液中的主要代谢产物为葡萄糖酸、 乙酸、 丙酸。 ㊀㊀关键词： 巨大芽孢杆菌； 诱变育种； 解磷机理； 高效液相色谱 ㊀㊀中图分类号：Ｓ １ ８ ２ ㊀㊀文献标志码：Ａ ㊀㊀文章编号： １ ０ ０ ２－ １ ３ ０ ２ （ ２ ０ １ ６ ） １ ２－ ０ ５ ３ ７－ ０ ３
［ ８ ］ 合作用是解磷菌 Ｋ 。研究表明， 巨大芽 ３ 解磷的主要机理 ９ ］ 。伊 孢杆菌有机酸主要代谢产物是葡萄糖酸、 乳酸和乙酸 ［
Ｓ Ｋ Ｙ－ ２ １ ０ ２ 苏坤实业有限公司
１ ． ２ ㊀菌株与培养基 菌种来源： 巨大芽孢杆菌 １ １ ４ ３ ３ ， 中国普通微生物菌种保 ． ２ ２ ３ 。 藏管理中心， 编号 １ 营养琼脂培养基： 蛋白胨 １ ０ｇ ／ Ｌ ， 牛肉膏 ５ｇ ／ Ｌ ， 氯化钠 ５ｇ ／ Ｌ ， 琼脂 ２ ０ｇ ／ Ｌ ， ｐ Ｈ值 ７ ． ０ ７ ． ２ ， １ ２ １ħ ２ ０ｍ ｉ ｎ 灭菌。 ０ｇ ／ Ｌ ， Ｋ Ｈ Ｐ Ｏ Ｈ Ｏ ６ｇ ／ Ｌ ， 种子 培 养 基： 葡萄糖 １ ２ ４· ３ ２ Ｋ Ｈ Ｐ Ｏ ／ Ｌ ， 尿素 １ ． ５ｇ ／ Ｌ ， 酵 母 粉 １ｇ ／ Ｌ ， Ｍ ｇ Ｓ Ｏ Ｈ Ｏ ２ ４ ３ｇ ４· ７ ２ ０ ４ １ｇ ／ Ｌ ， ｐ Ｈ值 ７ ． ０ ， １ ２ １ħ ２ ０ｍ ｉ ｎ 灭菌。 ０ｇ ／ Ｌ ， （ Ｎ Ｈ ） Ｓ Ｏ ． ５ｇ ／ Ｌ ， 无机磷发酵培养基： 葡萄糖 １ ４ ２ ４０ Ｎ ａ Ｃ ｌ ０ ． ３ｇ ／ Ｌ ， Ｋ Ｃ ｌ ０ ． ３ｇ ／ Ｌ ， Ｍ ｇ Ｓ Ｏ Ｈ Ｏ０ ． ３ｇ ／ Ｌ ， Ｆ ｅ Ｓ Ｏ ４·７ ２ ４· ７ Ｈ Ｏ０ ． ０ ３ｇ ／ Ｌ ， Ｍ ｎ Ｓ Ｏ ·Ｈ Ｏ０ ． ０ ３ｇ ／ Ｌ ， Ｃ ａ （ Ｐ Ｏ ） ／ Ｌ ， ｐ Ｈ ２ ４ ２ ３ ４ ２ ５ｇ 值７ ０ ７ ． ５ ， １ ２ １ħ ２ ０ｍ ｉ ｎ灭菌。 无机磷固体培养基： 葡萄糖 １ ０ｇ ／ Ｌ ， （ Ｎ Ｈ ） Ｓ Ｏ ． ５ｇ ／ Ｌ ， ４ ２ ４０
江苏农业科学㊀２ ０ １ ６ 年第 ４ ４ 卷第 １ ２ 期
任友花， 王羿超， 李㊀娜， 等．微生物肥料高效解磷菌筛选及解磷机理探究［ Ｊ ］ ．江苏农业科学， ２ ０ １ ６ ， ４ ４ （ １ ２ ） ： ５ ３ ７－ ５ ４ ０ ． ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ． １ ５ ８ ８ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ２－ １ ３ ０ ２ ． ２ ０ １ ６ ． １ ２ ． １ ５ ８
长发育良 好， 同 时可提高植物的 抗 寒 性和 抗 旱 性。肥 料 中
２＋ ３ ＋ ３ ＋ ７ ０ ％以上的水溶性磷与土壤中的 Ｃ ａ 、 Ｆ ｅ 、 Ａ ｌ 等结合， 转 ３ ］ 化为难溶性磷酸盐， 很难被植物也能分解难溶性磷化合
４ ］ 。因此， 在农业上常被用来做磷细菌肥料。 物［