过表达ICE1基因在转基因水稻中表达提高抗寒性

过表达ICE1基因在转基因水稻中表达提高抗寒性
摘要：ICE1，一种拟南芥的转录因子，通过RT-PCR方法克隆并通过农杆菌介导的转化方法成功转化到稻品种垦鉴稻10。

经过PCR扩增和Southern blot分析表明，ICE1已整合到水稻基因组中。

与非转基因植物相比，转基因植物表现出高抗潮霉素B，和转基因ICE1的单拷贝基因的孟德尔遗传一致。

在低温胁迫下，转基因植物表现出较低的死亡率，且脯氨酸含量增加。

这些结果表明，拟南芥的ICE1在水稻中起到功能，而且，过表达的ICE1可以提高水稻的冷胁迫的耐受性。

拟南芥的转录激活因子在低温下激活ICE1并刺激CBF / DREB基因表达。

随后，将活化的中CBFs/ DREBs结合CRT/ DRE顺势作用元件（GAC）在启动子区域，连同其它蛋白质（RNA聚合酶等）相互作用，最后诱导下游冷反应基因（COR）以及其他低温驯化基因表达。

这一过程通过改变可溶性糖和脯氨酸的含量，并最终提高了植物耐寒性。

ICE1的组成型表达提高了拟南芥抗寒能力。

克隆拟南芥CBFs/DREBs同源基因，在水稻中命名为DREB1A，OsDREB1B，OsDREB1C，OsDREB1D和DREB2A。

Chen等克隆OsDREBL大米，和Tian等[8]克隆水稻3转录因子（OsDR EB1-1，OsDR EB4-1和OsDR EB4-2）。

验证了，大部分的克隆的基因的可以在CRT/ DRE顺势作用元件下结合在COR启动子区域。

直到现在，大多数水稻抗寒基因已被分离和鉴定，但未见拟南芥ICE1基因在水稻中的相关报道。

此外，CBF基因的转录水平不受冷胁迫调控，这里一个潜在的分子生物学基础。

我们通过转化拟南芥ICE1提高水稻耐冷性提供。

在这项研究中，我们成功地将拟南芥转录因子基因ICE1转化到水稻品种垦鉴稻10，并研究了ICE1转化对水稻品种垦鉴稻10耐冷低温的影响。

植物材料
质粒和菌株
植物表达载体命名pCAMBIA1300-35S-ICE1-polyA的构建（图1），其中载有ICE1 cDNA片段和选择标记基因的HPT，抗对潮霉素B的CaMV 35S启动子。

培养基
愈伤MS +2 mg/L 2, 4-D +0.5 mg/L KT+0.5 mg/L NAA
再生MS+2 mg/L 6-BA
生根1/2 MS+0.5 mg/L NAA
基因克隆和植物表达载体的构建
通过酶切和序列分析检查后，ICE1的PCR产物用EcoR I和Xba I酶切，然
后在pRT104载体的CaMV35S启动和聚A之间插入，用PstⅠ酶切后，将CaMV35S 启动-ICE1-polyA的片段插入到pBluescript中质粒比用BamH I和Sal I消化CaMV35S启动-ICE1-polyA的片段插入到pCAMBIA1300载体
农杆菌介导的愈伤组织转化
从垦鉴稻10成熟胚诱导水稻愈伤组织由Hiei等报道了农杆菌介导的方法转化。

第二选择后，将潮霉素抗性愈伤组织转移至再生培养基并15小时光照的光周期下培养。

约2厘米高度将再生植物转移到生根培养基。

当植物达到了10厘米的高度，管盖被拔出。

两天后培养，将植物转移到盆中的土壤。

转基因植物进行试验以筛选阳性的。

转基因稻植物的检测
提取水稻的DNA进行PCR检测，并提取了全基因组DNA进行Southern blot.。

将DNA用EcoR I酶切，进行电泳，转印到膜上，并固定。

同时，野生型水稻DNA 和表达载体（ICE1和polyA多聚腺苷酸之间没有任何的EcoRI酶切位点，，图1之间的限制性位点）被分别用作阴性和阳性对照。

ICE1基因的探针根据DIG DNA 标记和检测试剂盒的说明合成和检测。

与固定单链DNA的膜浸渍在预杂交缓冲液。

预杂交后，将膜转移到含有标记探针的杂交溶液。

T1代和非转基因植物的种子表面灭菌，接种在100毫克/升潮霉素的MS培养基上。

潮霉素抗性T1代转基因后代的分离根据以下公式计算：χ2= (|A−3a|−2)2/3(A+a)
（A是潮霉素抗性的种子数量，a是数潮霉素敏感的种子，DF=1，α=0.05，χ2（0.05，1）=3.84）。

然后将潮霉素抗性的种子在土壤中播种。

当幼苗约10厘米的高度，它们在4℃经受冷处理在冰箱中3天，然后返回到23℃的恒定环境。

观察植物的生长，并计算低温处理后的枯萎速率。

水稻脯氨酸含量叶T1代和非转基因植物中的13天（冷处理前）和第16天（冷处理之后）的苗龄通过该方法，。

四个复制测量每个样品进行。

转基因水稻植株PCR检测
总共在研究43个体转基因稻植物的通过PCR检查。

约1500碱基的ICE1基因在12个单独的转基因植物（图5）被提出，但是否定的CK和其他个体植物不存在，这表明ICE1基因已整合到水稻基因组中为28％的转化率。

3，阳性控制对照组; 7，非转基因植物，阴性对照。

其余的是转基因植物转基因
水稻的Southern blot分析
一些转基因水稻的Southern blot分析表明，1800左右bp的碱基条带表明阳性的植物，没有条带可以从阴性对照来检测。

水稻基因组DNA用EcoRI酶切，并用ICE1基因的探针杂交。

第1泳道，阳性控制对照组;3，非转基因水稻植株，阴性控制对照组;泳道2，4至7，转基因植物
对T1转基因水稻产生对潮霉素抗性分析
图。

图7示出未转化的对照种子的萌发被抑制用100微克/ mL潮霉素的培养基上，而T0代的一些种子表现出高的耐潮霉素和发芽良好。

χ2检验（表1）表明，ICE1在T1代继承。

用于潮霉素抗性的分离比分别为3：1的大部分T0转基因品系，证明ICE1基因已整合到水稻基因组中的单拷贝。

一种转基因水稻品系（T0-24）没有显示出的分离比3：1，表明ICE1基因已整合到多拷贝或多站点的水稻基因组中。

（水稻为二倍体）
冷处理表明，非转基因植物死亡率约80％。

而转基因水稻品系T0-11-1和T0-39-1，以及约50％的其它三个转基因株系。

与未转化的对照植物相比，转基因植物表现出更强的耐冷性。

转基因株系T0-11-1和T0-39-1呈现弱萎蔫，低温萎凋和住宿。

这些结果表明，ICE1基因的过表达改善了转基因肯间岛10到一定程度的耐冷性。

在T1转基因水稻产生的脯氨酸含量
脯氨酸是更强的亲水性氨基酸。

较高的脯氨酸含量可以帮助细胞维持水与生物大分子结构，增强植物抗环境胁迫。

低温处理后，与非转基因的水稻相比，在转基因稻植物的脯氨酸含量有较高的增加幅度。

如示于图9，在转基因品系
T0-11-1和T0-39-1脯氨酸含量分别为1.1倍和0.8倍，那些在低温处理，分别与非转基因的水稻相比，提高到2.16倍及2.23倍。

这表明，在水稻的ICE1基因的过表达促进了脯氨酸的合成。

植物的抗寒性，复杂属性由多重因素的控制，主要是由基因决定的，同时受环境影响的。

有许多功能基因（如COR），调控基因（例如转录因子）调节到冷胁迫的植物反应，然而，它们的表达水平是正常的条件下的非常低的，因此，基
因表达调控系统在耐寒性至关重要的作用。

相比单功能基因的转化，转录激活物的转化是改善植物抗寒性的更有效的方法。

ilmour等人[4]获得的转基因拟南芥与CBF3/ DREB1A的过表达，并观察到CBF3的过表达调节下游靶基因的表达和增加的脯氨酸和糖的积累。

因此，他们推测，CBF3/ DREB1A基因调控不仅COR 基因，但可能还有其他抗逆基因赋予植物耐寒性提高。

Chinnusamy等[5，16-17]中分离出拟南芥的基因ICE1和报道，ICE1基因通过CBF3调控COR。

静等[9-10]得到了拟南芥CBF1转基因水稻植株，并证明，CBF1的过表达提高水稻植株抗寒能力和脯氨酸含量。

在这项研究中，我们也发现，ICE1的过表达增强水稻抗寒性及脯氨酸含量。

据推测，在ICE1基因活化稻OsDREBs，同源中CBFs/ DREBs 转录因子在拟南芥中，然后将活化的OsDREBs调节COR和水稻其他相关基因。

当然，需要通过更多的实验，来进行研究在低温胁迫下的转基因水稻的OsDREB 和COR基因的表达模式。