液相色谱使用教程

高效液相色谱法的类型
• 4．离子对色谱法 • 又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根 据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对 化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其 分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。
高效液相色谱法的类型 • 5．排阻色谱法
• 固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可 以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中， 滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接 随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各 组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子 化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。
• 反相色谱法
• 一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液， 常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机 溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。 RPC 在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC 应 用的80%左右。
正相色谱法与反相色谱法比较表
分离无机离子混合物的首选（离子色谱 法）；分离蛋白质、核酸样品及有关化 合物的良好选择
分离大分子样品，如蛋白质和人造聚合 物的良好首选，也可用于测量分子量的 分布
疏水作用 色谱法
用于分离蛋白质
步
骤
准 备
开 机
分测 析试
清关 洁机
LC-15C系统组成
• • • • 本系统由LC-15C送液单元 CTO-15C柱温箱 SPD-15C紫外可见双波长检测器 色谱数据工作站和电脑等组成， 另外还包括打印机、不间断电源 LC-15C液相色谱仪
表1
HPLC按分离机理的分类
类型
吸附色谱 分配色谱 凝胶色谱 离子交换色谱 离子排斥色谱 离子对色谱 疏水作用色谱 手性色谱 亲和色谱
分离机理
吸附能，氢键 疏水分配作用 溶质分子大小 库仑力 Donnan膜平衡 疏水分配作用 疏水分配作用 立体效应
分析对象或应用领域
异构体分离、族分离，制备 各种有机化合物的分离、分析与制备 高分子分离，分子量及其分布的测定 无机离子、有机离子分析 有机酸、氨基酸、醇、醛分析 离子性物质分析 蛋白质分离与纯化 手性异构体分离，药物纯化
等辅助设备。
第一步
准 备
1 、准备所需的流动相，用合适的0.45μm滤膜过滤，超声脱气20min。
2 、根据待检样品的需要更换合适的洗脱柱（注意方向）和定量环。 3、 配制样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），用合适的 0.45μm滤膜过滤。（注意：滤膜有水性与有机两种，选择合适的） 4 、检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正。
第二步
• 检查仪器各部件。
开 机
• 打开仪器电源开关、泵和检测器开关。
• 泵和检测器自检结束后，打开电脑显示器、主机，最 后打开色谱工作站
第三步 分析测试
（一）设置参数
1、 波长设定： 2 、流速设定： 3 、流动相比例设定：
4、 梯ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ设定：
（二）更换流动相并排气泡
液 相 色 谱 分 析
主 要 液 相 色 谱 方 法 特 性
方法 反相 HPLC 离子对 HPLC
正相 HPLC
样品特点/色谱柱
流动相：水/有机溶剂 色谱柱：C18（ODS），C8，苯基， 三甲基硅烷，氰基 流动相：水/有机溶剂（一种缓冲 物控制pＨ和离子对试剂） 色谱柱：C18（ODS），C8，氰基 流动相：有机溶剂混合液 色谱柱：氰基，二醇基，氨基，硅 胶
高效液相色谱法的类型 • 高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱
法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱 法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。 –1．液固色谱法 –使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理 是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离 过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。常用的吸附 剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10μ m。适用于分离分 子量200~1000 的组分，大多数用于非离子型化合 物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异 构体。
高效液相色谱法的类型
• 液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相 色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。 • 正相色谱法
• 采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相 为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷），常加入 乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。 常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类 及氨基酸类等）。
高效液相色谱仪使用浅析
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高效液相色谱法
• 概 述 高效液相色谱法的发展
• 在所有色谱技术中，液相色谱法（liquid chromatography， LC）是最早（1903年）发明的，但其初期发展比较慢，在液相色 谱普及之前，纸色谱法、气相色谱法和薄层色谱法是色谱分析法 的主流。到了20世纪60年代后期，将已经发展得比较成熟的气相 色谱的理论与技术应用到液相色谱上来，使液相色谱得到了迅速 的发展。特别是填料制备技术、检测技术和高压输液泵性能的不 断改进，使液相色谱分析实现了高效化和高速化。具有这些优良 性能的液相色谱仪于1969年商品化。从此，这种分离效率高、分 析速度快的液相色谱就被称为高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC），也称高压液相色 谱法或高速液相色谱法。 气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合 物，而HPLC则适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥 发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。现在， HPLC的应用范围已经远远超过气相色谱，位居色谱法之首。
高效液相色谱法的运用范围
★高效液相色谱法在常温下进行分离与分析，不会导致 被测物质的热分解，其流动相是液体，所以只要试样 能制备成溶液，原则上都可以用高效液相色谱法分离 与分析，如离子型化合物、不稳定天然产物以及氨基 酸、蛋白质等高分子化合物均可用高效液相色谱法获 得较好的分离效果。
高效液相色谱法的运用范围 • • • • 高效液相色谱分离方法的选择 ①选择的基本依据 相对分子质量的大小： ★对于相对分子质量在200以下、易挥发、热稳定性好 的化合物，可采用气相色谱法； • ★★相对分子质量在200～2000的化合物，可用液-固 色谱法、液-液色谱法、离子交换色谱法 • ★★★相对分子质量大于2000的试样，适宜用凝胶色 谱法进行分离
高效液相色谱法的运用范围 • 试样的溶解性
• ★能迅速溶于水的样品，可采用反相液-液色谱法； • ★★若试样全部或大部分能溶于HCl或NaOH溶液，表示试样 属于离子型化合物，可采用离子交换色谱法来分离； • ★★★溶于非水溶性溶剂(如己烷、异辛烷、苯、甲苯等烃 类)的试样，可选用液-固吸附色谱法3溶于二氯甲烷或三氮 申烷的试祥，选用常规的液-液色谱(正相色谱)法和吸附色 谱法； • ★★★★溶于甲醇等溶剂的试样，则可以用反相液-液色谱 法进行分离与分析。
生物 医药
高效液相色谱法的流程 液相色谱仪流程图
2
高压输 液泵
进样器
3
4
色谱柱
6 1
流动相 容器
5
7
废液瓶
工作站
检测器
液相色谱仪工作流程
• 现在的液相色谱仪一般都做成一个个单元组件，然后 根据分析要求将各所需单元组件组合起来。最基本的 组件是高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器和数据 系统（记录仪、积分仪或色谱工作站）。 • 液相色谱仪的工作过程：输液泵将流动相以稳定的流 速（或压力）输送至分析体系，在色谱柱之前通过进 样器将样品导入,流动相将样品带入色谱柱,在色谱柱 中各组分因在固定相中的分配系数或吸附力大小的不 同而被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的 信号送至数据系统记录、处理或保存。
高效液相色谱法的类型 • 广义地讲，固定相为平面状的纸色谱法和薄层色 谱法也是以液体为流动相，也应归于液相色谱法。不 过通常所说的液相色谱法仅指所用固定相为柱型的柱 液相色谱法。 通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、 分配色谱法、离子色谱法和凝胶色谱法四大类。其实， 有些液相色谱方法并不能简单地归于这四类。表1列举 了一些液相色谱方法。按分离机理，有的相同或部分 重叠。但这些方法或是在应用对象上有独特之处，或 是在分离过程上有所不同，通常被赋予了比较固定的 名称。
正相色谱法 反相色谱法
固定相极性
流动相极性 组分洗脱次序
高～中
低～中 极性小先洗出
中～低
中～高 极性大先洗出
高效液相色谱法的类型
• 3．离子交换色谱法 • 固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交 联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、 磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换 树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可 电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分 的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具 有不同的电荷吸引力而分离。 • 缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。
何时应用该方法
首选为能溶于水/有机混合物的中性或非 离子化合物。
离子或可电离化合物，尤其是碱性或阳 离子化合物的良好选择
当反相或离子对HPLC无效时的第二个较 好选择；首选为不溶于水/有机混合液的 亲脂样品，异构体混合物和制备HPLC 硅胶最好
液 相 色 谱 分 析
次 要 液 相 色 谱 方 法 特 性
高效液相色谱法的类型
2.液液色谱法 • 使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学 键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据 被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分 离。分离过程是一个分配平衡过程。 • 涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须 预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失； 温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的 变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分 离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定 液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键 合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
方法 离子交换 色谱法 体积排阻 色谱法 描述/色谱柱
流动相：水相，另以缓冲物控制pH 色谱柱：阳离子或阴离子交换 流动相：水相（GFC）或有机相 （GPC） 色谱柱：GFC用二醇基，GPC用聚苯 乙烯或硅胶，孔径大小支配分子量 范围 流动相：盐溶液 色谱柱：类似于反相填料，但疏水 性小得多
何时应用该方法
液相色谱分离模式的选择
• 分离方式是按固定相的分离机理分类的，选定了固定相（色谱柱） 基本上就确定了分离方式。当然，即使同一根色谱柱，如果所用流 动相和其它色谱条件不同，也可能成为不同的分离方式。选择分离 方式大体上可以参照图3
高效液相色谱法的运用范围 • ★气相色谱法适用于分析相对分子质量较小，容易挥 发成气体的物质。 • ★气相色谱法控制温度可达300℃，热稳定性差的物质 在此温度下将发生分解，但高沸点物质在此温度下也 不能完全气化 • ★高沸点、热稳定性差的有机化合物、以及相对分子 质量大(大于400)的有机物(约占有机物总数的 70%~80%)，均不宜应用气相色谱法进行分析，但可以 应用高效液相色谱法进行分析。
生化特异亲和力 蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分 析
HPLC在不同领域的主要应
• HPLC几乎在所有学科领域都有广泛应用，可以用于绝 大多数物质成分的分离分析，它和气相色谱都是应用 最广泛的仪器分析技术，HPLC在部分领域的主要分析 对象物质列于表2
表2 应用领域
环境
农业 石油 化工 材料 食品
HPLC在各领域的主要应用 分析对象举例
常见无机阴阳离子、多环芳烃、多氯联苯、硝基化合物、 有害重金属及其形态、除草剂、农药、酸沉降成分。
土壤矿物成分、肥料、饲料添加剂、茶叶等农产品中无机 和有机成分。 烃类族组成、石油中微量成分。 无机化工产品、合成高分子化合物、表面活性剂、洗涤剂 成分、化妆品、染料。 液晶材料、合成高分子材料。 无机阴阳离子、有机酸、氨基酸、糖、维生素、脂肪酸、 香料、甜味剂、防腐剂、人工色素、病原微生物、霉菌毒 素、多核芳烃。 氨基酸、多肽、蛋白质、核糖核酸、生物胺、多糖、酶、 天然高分子化合物。 人体化学成分、各类合成药物成分、各种天然植物和动物 药物化学成分。